利用基因芯片分析擬南芥中參與蠟質(zhì)生物合成的候選基因.doc

利用基因芯片分析擬南芥中參與蠟質(zhì)生物合成的候選基因摘要：植物表皮蠟質(zhì)組成疏水層覆蓋于植物器官的表面，構(gòu)成一層屏障以抵抗不受控制下的的水分流失和生物脅迫。蠟質(zhì)的生物合成需要大量酶的協(xié)同作用，主要參與長鏈飽和脂肪酸形成及轉(zhuǎn)化成幾種脂肪族復(fù)合物的過程。我們發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中有282個候選基因可能在蠟質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)和運(yùn)輸中發(fā)揮作用。為了鑒定最有意義的候選基因，我們通過實施基因芯片試驗來測定15d苗齡的擬南芥（地上部分）的204個基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)樣本中僅僅有25%的假定候選基因表達(dá)水平顯著，所以基因數(shù)量的顯著降低將值得利用反向遺傳學(xué)的方法來表明它們參與蠟質(zhì)的積累。我們鑒定出一個-酮酰基CoA合成基因At5g43760，它在大部分的組織和器官中受蠟質(zhì)基因CER6的共同調(diào)節(jié)。通過比較我們表明在15d苗齡的葉片和莖稈中脂酰CoA還原酶和蠟質(zhì)合成酶基因不表達(dá)，引發(fā)的問題就是關(guān)于參與乙酰還原途徑的酶大約占據(jù)總蠟質(zhì)的20%。引言 水是植物生存的必要條件。貫穿于植物生理，結(jié)構(gòu)和形態(tài)適應(yīng)的進(jìn)化過程中，植物需要在惡劣的環(huán)境條件下為了生存而保持最佳的水分狀態(tài)。事實上，眾所周知早期陸生植物的古生物化石中就出現(xiàn)了發(fā)達(dá)表皮和氣孔特殊結(jié)構(gòu)1,2。這兩種結(jié)構(gòu)是植物在光合作用氣體交換下控制水分流失到干燥的大氣中所必須的3,4。 植物生長在一個暴露的環(huán)境中應(yīng)該形成一種機(jī)制來抵御非控制下的水分流失。這種機(jī)制應(yīng)該是有效的，光合輻射透明，靈活和自我愈合的。植物的角質(zhì)層控制著表皮外側(cè)細(xì)胞壁和植物臨近大氣層之間水分的流動，并具有以下特征：它的膜比較薄（0.02-10um厚度），該膜為一多糖聚合物（角質(zhì)）和相關(guān)的溶劑可溶性脂類（蠟質(zhì)）5。角質(zhì)大多數(shù)是由C16和C18羥基脂肪酸通過酯鍵形成的三維聚合物6-10。 角質(zhì)層的蠟質(zhì)是一種由長鏈脂肪族化合物組成的復(fù)合物質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時也含有萜類和次級代謝產(chǎn)物，如固醇類和黃酮類。角質(zhì)層蠟質(zhì)的物理和化學(xué)特性決定植物的主要功能。事實上，蠟質(zhì)除了在保護(hù)植物的暴露部分免受非控制下水分的流失作用以外3,4，它還具有防止紫外輻射，減少灰塵、花粉和空氣污染物沉積的作用11。除此之外，還能夠確信植物表面的蠟質(zhì)在抵御細(xì)菌和病原菌感染上發(fā)揮重要作用12，同時還參與植物和昆蟲的互作。含有20-32個碳原子的飽和長鏈脂肪酸的形成需要大量酶的參與13，它們進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化成集中脂肪族復(fù)合物形成了蠟質(zhì)層（圖1）。兩種主要的蠟質(zhì)生物合成途徑共存于植物的表皮細(xì)胞：一種是?；€原途徑，主要產(chǎn)生伯醇和蠟酯，另一個是脫羰基途徑，主要形成醛類，烷類，仲醇和酮類14。在不同種類的植物中已經(jīng)分離出幾個蠟質(zhì)突變體11,14-16。擬南芥中的突變體loci被命名為eceriferum（cer），在這個模式植物中已經(jīng)鑒定出了22個獨(dú)立的cer位點(diǎn)。突變體顯示出蠟質(zhì)組成不規(guī)則或蠟質(zhì)成分的整體減少17-20。過去幾年中，五個CER基因已經(jīng)被克隆出來（CER1,2,3,5和6），但是僅僅CER5和CER6相對應(yīng)的蛋白質(zhì)生物功能是確定的，他們分別編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和一種延長酶復(fù)合物的縮合酶11,12。進(jìn)一步的利用擬南芥cer突變體，將更多的編碼參與蠟質(zhì)生物合成的蛋白質(zhì)基因進(jìn)行克隆和分析。一個位于玉米中的GLOSSY8突變體（GL8）導(dǎo)致長于C24蠟質(zhì)復(fù)合物水平的降低。后期顯示出相對應(yīng)的基因編碼一種還原酶，其參與VLCFAs的合成22,23。蠟合成酶（脂?；鵆oA:脂肪醇酰基轉(zhuǎn)移酶），催化線性脂合成的最后一步，它是從發(fā)育的荷荷巴胚胎中被分離和純化的。并進(jìn)行了相對應(yīng)基因的克隆24。近年來，WINI/SHINEI被進(jìn)行說明，它是一個Arabidopsis thaliana乙烯響應(yīng)類型的轉(zhuǎn)錄因子，其過量表達(dá)能夠上調(diào)葉片和莖稈中蠟質(zhì)的產(chǎn)生25,26。我們目前的認(rèn)識所以被局限在不同植物種類的有限的基因數(shù)量上，幾種方案已經(jīng)被研究來探索蠟質(zhì)生物合成的其它途徑。這些方案中一部分主要依賴于對候選基因庫的鑒定，這些候選基因在蠟質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)和運(yùn)輸上發(fā)揮作用，一旦預(yù)測了它們的功能，那么它們的同系物和表達(dá)類型也會被知曉。在最近的研究報道中，Kunst and Samuels 11建立了35個基因列表，其編碼蠟質(zhì)生物合成酶。我們利用他們的列表作為起點(diǎn)，經(jīng)公開的數(shù)據(jù)庫檢測后增加到了147個候選基因（TIGR，TAIR，Arabidopsis膜蛋白庫， Arabidopsis脂蛋白基因庫）。而且，近來發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在蠟質(zhì)沉積中發(fā)揮作用21，我們添加了135個編碼ABC蛋白的基因于列表中，使基因總數(shù)達(dá)到了282個。在已經(jīng)鑒定出來的282個候選基因中，我們在15d擬南芥地上部分植物中研究了204個基因的表達(dá)：18個-酮酰CoA合成酶（KCS），2個-酮酰CoA還原酶（KCR），5個反式-2-烯酰CoA還原酶（ECR），6個酯酰-CoA還原酶（FAR），10個蠟質(zhì)合成酶（WS），3個雙官能團(tuán)WS/DGAT（?；?CoA：甘油?；D(zhuǎn)移酶），37個脂轉(zhuǎn)移蛋白（LIP），113個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和10個CER-相關(guān)基因。2.材料和方法2.1植株材料Arabidopsis thaliana常用的三種生態(tài)類型：（Ler-0，cer-1，cer3-1和cer6-2）種子是從諾丁漢擬南芥庫存中心中獲得的（庫存號NW20，N31，N33和N6242）。種子表面消毒后放于含有發(fā)芽培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中27。種子4低溫處理2d以確定正常萌發(fā)后再進(jìn)行周期光照。將擬南芥植物栽種在長日照條件下（16h光照/8h黑暗）22， 80%相對濕度。播種15d后收集植株的地上部分，冰凍于液氮中，-80儲存。擬南芥的表現(xiàn)型Columbia（Col-0）用來進(jìn)行黑暗/光照試驗，CER6和At5g43760mRNAs用來進(jìn)行組織分析試驗。種子的消毒盒植株的栽種依據(jù)上述描述進(jìn)行。對于黑暗試驗，將1/2數(shù)量15d苗齡的植株轉(zhuǎn)移到黑暗條件下24h，其余的植物仍舊放在正常的條件下。然后，收集植樹的地上部分，冰凍在液氮中，-80儲存。對于Arabidopsis thaliana表達(dá)的研究，需要將植株栽種在長日照條件（16h 光照和8h黑暗），22和80%相對濕度。將培養(yǎng)皿中播種20d后的植株轉(zhuǎn)移到土壤中，同樣條件培養(yǎng)30d，然后收集植株冷凍于液氮中。2.2 RNA的提取和探針熒光標(biāo)記為了減小雜株的可變性，將20個植株組織中的提取的RNA合并。對于表現(xiàn)型cer-2，cer3-1和Ler-0，分別進(jìn)行RNA的純化（僅對cer1-1）。利用氯化銫進(jìn)行植株地上部分總RNA的提取。通過260nm分光光度法來確定RNA的數(shù)量，再利用凝膠電泳來分析核糖體RNA條帶評價其完整性。對于每個基因芯片試驗，利用安捷倫熒光標(biāo)記試劑盒按照說明書（Agilent 技術(shù)），將20ugRNA用作模板來合成被標(biāo)記的cDNAt探針。利用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP（Perkin Elmer/NEN）進(jìn)行試驗。2.3探針雜交，沖洗和掃描 cer突變體和野生型植株之間的比較研究中使用了14個Agilent擬南芥-1基因芯片。針對13704個擬南芥基因每個排列包含60-mers長度寡核苷酸特異性探針和440個控制位點(diǎn)。 每個芯片使用200ul的雜交液。雜交盒在60旋轉(zhuǎn)設(shè)置為8的雜交箱（Robbins scientific）中培養(yǎng)17h。培養(yǎng)的后期，條帶在室溫下按照0.5SSC和0.1%SDS5min和0.06SSC2min.順序依次沖刷。隨后，室溫下通過400g離心干燥。利用一個清晰度為10um的雙激光芯片掃描儀在cyanine3 532nm和cyanine5 633nm條件下掃描雜交芯片面。2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Agilent表征提取軟件A.6.1.1定量的鑒定雜交點(diǎn)強(qiáng)度。通過使用小量信號排列和散點(diǎn)均勻度方法設(shè)置如下：均勻度的離散度標(biāo)記，總體離散度的標(biāo)記以及背景的差減。為了將不同芯片試驗結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，我們使用每個對照樣本所獲得的平均值（Ler-0）28。計算每個基因的平均信號強(qiáng)度和它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差。2.5 Real-time PCR條件和分析 利用RNeasy 植物少量試劑盒來分離總RNAQiagen, USA).。利用含有DNase的DNA純化試劑盒來處理純化的RNA(Ambion, Austin, TX)，利用1.5%(w/v)驗證RNA的完整性。依據(jù)oligo(dT)18引物和SuperScripti TMII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, GmbH)說明書，將20ul反應(yīng)體系中的總RNA(2 ug)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA稀釋10倍，2ul作為Real-time PCR試驗的模板?；蛱禺愋砸锪杏诒?. 為了建立一個標(biāo)準(zhǔn)的定量曲線，每個PCR產(chǎn)物都需要在pGEM-T質(zhì)粒中r(Promega, USA)被克隆。通過DNA熒光定量試劑盒來定量質(zhì)粒(Sigma-Aldrich, France)。將質(zhì)粒按106至102 copies/uL濃度進(jìn)行稀釋，用作Real-time PCR對照的摸板。所有的標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行三次重復(fù)分析，實驗樣本進(jìn)行四次重復(fù)分析。 Real-time PCR試驗在a iCycler i (Bio-Rad,USA)上進(jìn)行。在25ul含有1SYBR熒光定量混合物和30nM引物。熱量曲線條件為953min 30s 1個循環(huán)，9530s 和601min 40個循環(huán)。每個曲線的數(shù)據(jù)采集和分析利用iCycler i iQ軟件進(jìn)行操作(version 3.0a, Bio-Rad)。 每個轉(zhuǎn)錄的相對拷貝數(shù)通過未知樣本Ct值與每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的插值來決定的。確定每個樣本中的actin 2，EF-1-a和eIF-4A-1mRNAs的量，用來標(biāo)準(zhǔn)化具有差異的總RNA量 29。3.結(jié)果和討論3.1 cer-突變體中蠟質(zhì)基因表達(dá)的分析 為了研究新的擬南芥基因是否參與表皮蠟質(zhì)的生物合成，我們將正常擬南芥植株和cer突變株之間的進(jìn)行了對比分析。我們利用以下的標(biāo)準(zhǔn)來選擇cer突變候選體：（）鑒定和克隆突變基因。（）清晰的確立了突變體的表型（）總蠟質(zhì)條帶或不規(guī)則蠟質(zhì)組分的生物化學(xué)研究表現(xiàn)出顯著的降低?；谏鲜鰳?biāo)準(zhǔn)，我們選擇了cer6-2，cer1-1和cer3-1突變體。大量研究表明，這三個突變體在蠟質(zhì)產(chǎn)生中存在著明顯的缺陷17,18,30,31。將突變株種植，提取15d地上部分的RNA并純化，用于基因芯片試驗。我們選擇生長階段進(jìn)行試驗，因為在這個階段cer突變株和野生型的葉片區(qū)域蠟質(zhì)沉積的差異是具大的32。隨后，14個獨(dú)立基因芯片試驗被實施：6個cer6-2/cer-0，6個cer3/Ler-0和2個cer1/Ler-0。對于6個CER基因的基因芯片獲得的試驗數(shù)據(jù)列于表2中。這些數(shù)據(jù)清晰的表明，在cer突變株和野生株之間標(biāo)記的CER基因都沒有顯示出雙重差異性表達(dá)。除了Real-time PCR試驗證實這些結(jié)果之外（表2）。并且，選擇的204個候選基因沒有在基因芯片上顯現(xiàn)出雙重表達(dá)。盡管在蠟質(zhì)合成中存在著顯著地缺陷，然而這些試驗數(shù)據(jù)表明cer6-2，cer1和cer3突變株中CER基因的mRNA穩(wěn)定水平接近于正常值。我們總結(jié)出，通過正常植株和cer突變植株的基因表達(dá)比較來鑒定參與蠟質(zhì)生物合成的基因是一個無效的方法。我們所以采用了另一種研究方式來篩選候選基因。3.2 15d野生型擬南芥地上部分蠟質(zhì)基因的表達(dá)表皮細(xì)胞一旦暴露在空氣并持續(xù)幾周，蠟質(zhì)就開始了積累5。在擬南芥中，每片葉子角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積在發(fā)芽的15d和25d是相似的，然而在同一時期葉片區(qū)域的增加很顯著，表明在這些階段蠟質(zhì)的生物合成是非?；钴S的32。在衰老的植株中，蠟質(zhì)的生物合成似乎不太活躍：萌發(fā)40d后擬南芥葉片蠟質(zhì)的積累降低到了60%32。這些發(fā)現(xiàn)說明了在植物萌發(fā)第4周的地上部分中參與蠟質(zhì)生物合成的基因表達(dá)上升。然而，我們的研究僅僅致力于在擬南芥生長過程中一個蠟質(zhì)生物合成基因，CER6基因的表達(dá)。在1d苗齡的中探測到了相應(yīng)的mRNA，當(dāng)苗齡達(dá)到8d的時候達(dá)到了最大的穩(wěn)定水平，并在擬南芥葉片的整個生長過程都探測到了33。為了拓寬我們的視野，我們測定了萌發(fā)15-28d擬南芥種苗地上部分編碼延長酶（KCRGLOSSY8和ECR TSC13）的2個CER基因葉片中的mRNA。我們采用了置于黑暗下24h的15d種苗作為樣本對照。事實上，蠟質(zhì)的積累是受光照調(diào)節(jié)的34CER6的轉(zhuǎn)錄受黑暗條件抑制33。我們結(jié)果是利用real-time PCR 獲得的（表3）。對于每個基因的mRNA萌發(fā)后15-28d的穩(wěn)定狀態(tài)水平相似，由此說明了在這個時期蠟質(zhì)生物合成的比率是上升至恒定。從放置于黑暗下24h的植株獲得結(jié)果證實了這個說法。在缺乏光照的植株中CER6 mRNA的穩(wěn)定水平CLossy8和TSC13是降低的?？傊@些結(jié)果顯示出15d擬南芥種苗中蠟質(zhì)基因的表達(dá)是上升的，我們利用這個標(biāo)準(zhǔn)來篩選候選基因。3.3基因芯片數(shù)據(jù)的分析 對于13704基因的研究（接近于擬南芥的半個基因組）平均強(qiáng)度大約在1600，2555個基因（18.6%）的信號強(qiáng)度平均強(qiáng)度。陰性對照的平均強(qiáng)度（每列180空點(diǎn)）是24629，6912個基因（總數(shù)50.4%）的信號值500，表明在樣本中信號水平不被表達(dá)。 重要的是，利用基因芯片試驗測定的相對表達(dá)水平與預(yù)先通過Real-time PCR技術(shù)是相似的。通過兩種技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)表明CER6 mRNA是最豐富的，隨后是GLOSSY8，TSC13和CER3mRNA（表3）。所以，對于這些基因，Real-time PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)獲得數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性是合理的。3.4 參與VLCFA生物合成途徑的酶 主要的表皮蠟質(zhì)成分是由帶有C20-C32長度飽和的VLCFAs組成的13,14,35，所以在質(zhì)體中蠟質(zhì)生物合成途徑的第一步發(fā)生在C18：0脂肪酸的延長。脂肪酸的延長需要4種酶促反應(yīng)，主要通過KCS,KCR ,-羥烷基CoA脫水酶（DCH）和ECR來催化的。目前為止，我們沒有關(guān)于DCH的信息，所以在這里我們僅僅討論KCS，KCR和ECR的作用。KCS催化帶有長鏈酰基載體丙二酰CoA的縮合反應(yīng)。這是VLCFA合成的限速步驟，其決定著VLCFAs?；L鏈的產(chǎn)生36。來自擬南芥的4種KCS已經(jīng)被研究出來。單一的縮合酶，F(xiàn)AE1，催化種子中VLCFA的合成36,37，另一方面，KCS138，F(xiàn)DH39,40和CER630,41，參與蠟質(zhì)成分的合成。Millar et al. 41研究在擬南芥的莖稈CER6的加倍KCS和FDH活性沒有發(fā)揮顯著的功能。另一種VLCFA縮合酶CER6030，與CER6的氨基酸序列高度相似，也沒有顯現(xiàn)出對莖稈表面脂質(zhì)的合成發(fā)揮顯著作用，同時在嫩枝的表達(dá)水平很低33。關(guān)于擬南芥脂質(zhì)基因數(shù)據(jù)庫的一項研究顯示存在的16個KCS相關(guān)基因總數(shù)已達(dá)到21個。為了進(jìn)一步的了解這個酶家族，我們利用CLUSTAL W來進(jìn)行序列比對（1.83）43并利用TreeView構(gòu)建了系統(tǒng)樹44（圖2）。從這個發(fā)育樹中我們可以看出，KCS的四個家族并在擬南芥中也被預(yù)先的進(jìn)行了描述。最小的家族由兩個成員組成，分別為CER6和CER60。正如先前的研究，在種苗的地上部分中測定CER6的表達(dá)是高水平的。然而，CER60是大量表達(dá)的，并且要比CER6 表達(dá)水平高1/2的事實很令人驚訝，因為過去報道的這個基因的表達(dá)水平要比CER6低33。如前面研究所述，這也許就說明了在蠟質(zhì)的積累過程中CER60發(fā)揮重要作用，并且在生長階段要求高水平的蠟質(zhì)積累33。從FDH家族的7個序列來看，有3個在我們的樣本中是不表達(dá)的。在擬南芥脂質(zhì)基因數(shù)據(jù)庫的一項研究顯示At5g49070和At1g71160不存在EST，表明這兩個基因或許是假定的基因，或許是在罕見的生理條件下才表達(dá)的基因。關(guān)于At3g52160的一個EST在花朵的cDNA文庫中被鑒定出來，然而，由于其在我們的樣本中沒有表達(dá)，所以不可能說這個基因在莖或葉片蠟質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。依據(jù)當(dāng)前的研究基礎(chǔ)，F(xiàn)DH的表達(dá)是大量的，其與CER6表達(dá)量相似。另外3個基因，At5g04530，At1g07720和At2g28630彼此之間表達(dá)水平相互接近于中度。它們的表達(dá)水平暗示著在蠟質(zhì)生物合成中可能會升高。在擬南芥基因組中相關(guān)的種子特異性縮合酶FAE1的6個基因被鑒定出來。其中之一，At4g34250在基因芯片中未顯現(xiàn)出來，但是從擬南芥脂質(zhì)基因數(shù)據(jù)庫中7個種子cDNA數(shù)據(jù)庫的5個EST數(shù)據(jù)表明KCS在種子的油脂產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。FAE136,37說明了這個作用，在我們的樣本中我們并沒有測定出關(guān)于這個基因的轉(zhuǎn)錄水平。所以在15d擬南芥種苗的地上部分表達(dá)出中度水平的3個基因：At1g19440，At2g16280和 At2g15090屬于一個家族。這3個基因或許催化葉片和莖稈中的一個縮合反應(yīng)類似于擬南芥種子中FAE1完成的功能。最后一個家族由6個成員組成，相對應(yīng)的KCS1基因特征由Todd etal描述38。從我們排列中呈現(xiàn)的4個序列來看，兩個基因表達(dá)水平為中度，At1g01120（KCS1）和At2g26640，其中一個At5g43760表達(dá)水平與CER6相當(dāng)。利用real-time PCR技術(shù)對At5g43760基因的表達(dá)水平做進(jìn)一步的研究。首先，我們比較了正常日照條件或24h黑暗條件15d苗齡植株相應(yīng)的RNA表達(dá)水平。At5g43760 mRNA的數(shù)量在缺乏光照的條件下呈顯著下降。我們測定了一個黑暗A(chǔ)t5g43760 mRNA與光照條件下的比率為0.557，其與TSC13的表達(dá)量相當(dāng)（表3）。我們也測定了不同擬南芥器官中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量并比較了攜帶CER6 mRNA的在組織上的分布（圖3）。研究結(jié)果表明兩個mRNA物種被共同調(diào)節(jié)，在莖葉中高度表達(dá)，在叢生的葉片、莖稈、花朵和果實中表達(dá)水平略低，在根中表達(dá)不顯著。所以，植物地上部分At5g43760的大量轉(zhuǎn)錄，光照或黑暗試驗不同器官CER6的表達(dá)說明了KCS在蠟質(zhì)積累中發(fā)揮作用。然而，近來研究表明在酵母中At5g43760的基因產(chǎn)物可能催化VLCFAs的形成45。通過利用有效的4個SALK突變株來證明蠟質(zhì)生物合成過程中這個基因的假定作用可能是有所提高的。最后，從18個KCS研究中發(fā)現(xiàn)，在植株的地上部分中有12個是表達(dá)的，在它們之中有3個mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出高水平：CER6、FDH和At5g43760。在VLCFA合成的第二個階段需要將3-羥烷基-CoA還原成-酮脂酰CoA，這是由一個KCR催化的反應(yīng)。近來在啤酒酵母中鑒定出一個假定的KCR、YBR159w46，并在擬南芥基因組中進(jìn)行了同系物的研究，鑒定出來2個候選基因At1g67730和At1g24470。研究表明At1g67730功能互補(bǔ)于ybr159突變株，在玉米基因中At1g67730的突變體會導(dǎo)致蠟質(zhì)的缺乏正如glossy822,23。沒有記錄關(guān)于At1g24470基因的生物作用。在我們的樣本中測定了這2個基因的mRNA表達(dá)水平，獲得數(shù)值為At1g67730 1971455（n=9）和 427217 （n =8)）At1g24470。這些結(jié)果表明At1g67730表達(dá)呈顯著水平，正如期望的這個基因編碼延長酶復(fù)合物的組成成分。另一方面，由于它的表達(dá)水平較低，在擬南芥基因組中鑒定出的在第二個KCR候選體在蠟質(zhì)前體的延長過程中發(fā)揮重要作用，因為前體的延長是緩慢的。VLCFA合成的最終反應(yīng)是通過trans-2、3Enoyl-CoA還原酶催化的。在酵母中鑒定出編碼這組酶的第一個基因TSC1347。研究表明TSC13是酵母生存所必需的，它催化所有鏈延長過程中以乙酰CoA為底物脂肪酸延長的循環(huán)反應(yīng)。利用TSC13蛋白序列鑒定出擬南芥基因組中的一個同系物At3g55360，其與哺乳動物的類固醇5-還原酶相似。關(guān)于TAIR數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步研究表明具有相似特征的5個基因被鑒定出來：At1g72590、At2g16530、At2g38050、At3g55360和At5g16010。5個序列比對后顯示前3個序列相近，說明了它們或許退化相似的反應(yīng)，但是它們在我們的樣本中沒有表達(dá)。相反，At3g55360和At5g16010的相對表達(dá)值分別是1833427 （n =8）和96361507(n =9)。如上所述，前者是TSC13同系物，其功能補(bǔ)充了酵母tsc13突變體48。測定At5g16010的表達(dá)水平顯著的高于At3g55360，表明相應(yīng)的蛋白在這個生長階段發(fā)揮重要的作用。延長酶復(fù)合體合成后，VLCFAs或者進(jìn)入?；€原途徑，主要進(jìn)行乙醇和蠟質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或者進(jìn)入脫羰途徑，而形成醛類、烷烴類、仲醇和酮類。3.5參與脂酰還原途徑的酶 ?；€原途徑是將VLCFA轉(zhuǎn)化為長鏈的伯醇和酯類。在許多高等植物中，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層的蠟質(zhì)中具有這些分子，然而有一些將產(chǎn)生長鏈醇和脂肪酸合成的線性酯類從而作為種子油能源儲存。事實上，我們對這個途徑的了解還是來源于對荷荷芭種子的研究。酰基還原途徑的第一步包括VLCFA前體伯醇的形成。這個反應(yīng)是由脂酰CoA還原酶（FAR）催化的49。第一個FAR基因是從荷荷芭50中鑒定出來的，隨后從擬南芥中鑒定出8個相關(guān)序列11。其中擬南芥的MS2編碼花粉形成的必要物質(zhì)膜特異性蛋白51。事實上，推測FAR類酶參與擬南芥角質(zhì)層脂質(zhì)的蠟酯部分醇類的形成過程。我們的結(jié)果不支持這個假設(shè)。6個FAR基因都沒有出現(xiàn)在我們的排列中，也沒有在15d植株的地上部分表達(dá)出顯著的水平（表4）。關(guān)于其它的兩個FAR基因，At3g56700和At4g33790，在TAIR網(wǎng)頁中沒有發(fā)現(xiàn)與At3g56700相關(guān)的EST，而來自NASCArrays的有效數(shù)據(jù)表明At4g33790僅在擬南芥的根部表達(dá)?？傮w來說，目前為止在擬南芥基因組中沒有鑒定出來FAR基因在蠟質(zhì)積累過程中發(fā)揮重要作用。這個途徑的最終反應(yīng)是由一個脂酰CoA催化的：脂肪醇?；D(zhuǎn)移酶(E.C.2.3.1.75,蠟質(zhì)合成, WS)。純化的WS來自于荷荷芭的胚胎，并克隆相應(yīng)的cDNA24。然后，荷荷芭WS的12個擬南芥同系物的ORFs被鑒定出來11,42，推測這幾個基因是擬南芥葉片和莖稈中角質(zhì)層蠟質(zhì)產(chǎn)生的必要因子11。我們的結(jié)果不支持這個假設(shè)。10個WS基因都沒有呈現(xiàn)在我們的基因芯片中，也沒有在15d植株的地上部分呈現(xiàn)顯著的表達(dá)水平（表3）。然而，在擬南芥數(shù)據(jù)庫中也沒有鑒定出任何WS的EST42。我們的研究表明在15d擬南芥葉片和莖稈中FAR基因和WS基因都不表達(dá)，這個結(jié)果出乎意料。酰基還原途徑占居總蠟質(zhì)數(shù)量的20%52，在Ler 基因型25d植株莖稈和葉片中伯醇和酯的數(shù)量分別占居總蠟質(zhì)數(shù)量的5%和2.3%、 3.5%和19.5%20。為了解釋這些矛盾的結(jié)果，我們提出了兩種假設(shè)。第一種是FAR和WS酶的氨基酸序列參與蠟質(zhì)合成過程伯醇和酯產(chǎn)生不同于荷荷芭種子酯的產(chǎn)生，所以它們沒有被鑒定出來。事實上，一種新型的雙官能團(tuán)蠟質(zhì)合成酶/脂酰CoA：甘油?；D(zhuǎn)移酶在Acinetobacter calcoaceticus中被描述53。作者在擬南芥基因組中鑒定出11個雙官能團(tuán)酶相關(guān)序列，我們假定，它們在蠟質(zhì)生物合成中發(fā)揮作用。在我們的芯片中發(fā)現(xiàn)了3個基因（At3g49210，At3g49190和At3g49200），但是各自的信號強(qiáng)度分別是272，243和301，表明在我們的樣本中他們沒有表達(dá)出顯著水平。然而，從NASCArrays的數(shù)據(jù)表明，這個家族的其它兩個成員At5g12420和At5g37300在不同的條件下表達(dá)量較低較顯著，我們不能排除它們在蠟質(zhì)的合成中發(fā)揮重要作用。第二種假設(shè)是蠟質(zhì)和伯醇的合成途徑是可選擇的。事實上，早期的生物化學(xué)研究表明伯醇的產(chǎn)生可能需經(jīng)歷兩個過程，并通過兩個單獨(dú)的酶來催化，一種是將VLCFAs還原成醛類的NADH依賴型酰基CoA還原酶，另一種是將醛類還原成伯醇的NADPH依賴型醛還原酶54。當(dāng)證實了VLCFA通過一個存在于豌豆葉片49和荷荷芭50胚胎中的單一脂酰CoA還原酶（FAR）催化形成醇類后，這個假設(shè)被推翻了，但是在擬南芥種苗中這個說法至今為止沒有被證實。3.6脫羰基反應(yīng)途徑 在擬南芥的莖稈中脫羰基反應(yīng)占據(jù)總蠟質(zhì)的80%。這個途徑起始于膜結(jié)合脂酰CoA還原酶的VLCFA前體形成醛類產(chǎn)物。這些醛類物質(zhì)通過醛類脫羥酶羥基化形成奇數(shù)鏈烷烴。隨后的步驟在于烷烴的羥基化形成仲醇，仲醇氧化形成酮類。 驚訝的是，盡管這個途徑提供了擬南芥蠟質(zhì)的大量合成，然而關(guān)于編碼四個不同酶類基因鑒定的信息特別少。對于cer1突變株報道說明了CER1編碼一個醛類脫羰基酶18,55。CER1序列（At1g02205）的獲得并沒有幫助我們證實其生物化學(xué)功能56，玉米和Kleinia odoraCER1同系物的克隆增強(qiáng)了這些基因或許編碼膜結(jié)合受體的可能性57。近來，兩個研究團(tuán)隊同時的鑒定出一個新的擬南芥CER-1相關(guān)基因，命名為WAX或YRE58，59，CER1有30%的氨基酸被鑒定相出來。相應(yīng)基因的突變體形成一個cer表現(xiàn)型，突變體蠟質(zhì)成分的分析形成一種假設(shè)WAX2/YRE催化?；鵆oA到醛類的轉(zhuǎn)化58,59。 在擬南芥基因組中我們鑒定出5個CER-1相關(guān)基因：At1g012190、At1g02205、At2g37700、At5g28280和At5g57800。在我們的樣本中僅有2個進(jìn)行了表達(dá)，At1g02205/CER1（998401）和At5g57800/WAX2/YRE（2027144，n=9）,所以證實了它們在蠟質(zhì)積累中發(fā)揮重要作用。3.7其它的Cer基因（CER2/CER3） Cer2蠟質(zhì)組分的分析表明在C28和C30組件上是缺乏的，表明CER2蛋白在C26脂肪酸延長上發(fā)揮重要作用18,55。CER2基因特征不能提供其生物化學(xué)功能60,61，但是CER2蛋白在核膜上的定位表明其是一個在角質(zhì)層蠟質(zhì)積累的調(diào)控者62。近來，一個來自Catharanhtus roseus的乙酰CoA：脫4-O-?；D(zhuǎn)移酶推動了擬南芥基因組中13個?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)序列的鑒定，包括CER263。有趣的是，鑒定出來的13個?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)序列包含在02458蛋白質(zhì)家族中。在TAIR數(shù)據(jù)庫中，我們鑒定出41個包含在02458蛋白質(zhì)家族中的轉(zhuǎn)移酶，并將它們的序列進(jìn)行了比較（圖4，補(bǔ)充的數(shù)據(jù)）。比對的結(jié)果表明大約有6個序列與CER2蛋白相關(guān)。其中4個mRNA的表達(dá)水平在我們的基因芯片試驗中被測定出來。At3g23840和At2g46110在我們的樣本中不被表達(dá)。有趣的是，CER2 mRNA的量是穩(wěn)定的，從而說明了CER2是一種調(diào)節(jié)蛋白而不是一種生物合成酶。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)At4g13840也稱為類CER2，其在我們的樣本中高度表達(dá)。不幸的是，關(guān)于這個基因功能信息幾乎沒有，要求我們對擬南芥突變體做進(jìn)一步分析研究At4g13840是否在蠟質(zhì)生物合成中發(fā)揮作用。 奇怪的是沒有在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)CER3基因（At5g02310）相關(guān)序列。cer3突變株的生物化學(xué)組分研究表明相應(yīng)蛋白質(zhì)參與脂肪酸的延長18。然而，CER3基因序列顯示出相應(yīng)蛋白質(zhì)的1個假定的核定位序列和2個磷酸化位點(diǎn)參與細(xì)胞核蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)15,64。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)出一種假設(shè)為CER3或許編碼一個調(diào)控蛋白。了解到細(xì)胞核調(diào)控蛋白通常低水平表達(dá)，我們的結(jié)果與CER3的這個假設(shè)相矛盾。事實上，測定這個基因的相對表達(dá)水平為993307（n=9）呈顯著水平，但是低于編碼生物合成酶的基因CER6。這個結(jié)果通過我們的PCR試驗被證實（表3）。3.8 蠟質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 經(jīng)歷合成到分泌途經(jīng)后，蠟質(zhì)成分積累在表皮細(xì)胞的質(zhì)膜上。然后，它們必須離開疏