顯微注射針的制作.doc

注射針的制作注射針是內(nèi)含玻璃細絲的薄壁毛細吸管，它可以通過毛細管虹吸作用進行載樣。用拉針儀（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具體操作程序詳見產(chǎn)品說明書）可以把注射針水平或垂直扯下來。必須保證制備的毛細管可以進入拉針儀這樣加熱組件大約在毛細管的中央位置。一般用內(nèi)徑為1.0mm的微電極管為材料制作注射針,微電極管可以買到,它與拉針儀是匹配的。另外，應(yīng)該對拉針儀的設(shè)置進行選擇，使細絲溫度和扯拉力度(主拉力和次拉力)將處于最佳狀態(tài)。具體需要預(yù)實驗來確定其最佳設(shè)置。待用注射針應(yīng)該用蒸餾水嚴格清洗以除去殘留炭化物顆粒。嚴格的實驗微電極管在使用前應(yīng)經(jīng)過泡酸、泡蒸餾水和硅化的程序,但有人省略了此步也有較好的結(jié)果,經(jīng)拉針儀拉針后就沒法清洗,好的拉針儀是不會殘留炭化物顆粒,若拉成后清洗其針尖很容易斷掉,可用Narishige Japan model PN-30。持卵管制作為避免機械損傷，持卵管口應(yīng)該是鈍性末端而且其孔隙有限，使受精卵輕輕依附在負壓管道中。這種高度密實可抵抗密封系統(tǒng)的破損，而密封可以減少受精卵注射時的旋轉(zhuǎn)運動。持卵管的口部應(yīng)該光滑，平整及與其長軸垂直。具體制備操作：雙手執(zhí)毛細玻璃管的兩端，將管的中部置酒精燈外焰燒紅至變軟后離開火焰，同時雙手外伸，將燒軟的部分拉細。用玻璃刀或細沙輪小心將細管切開，在鏡下觀察切口應(yīng)平齊(如不平齊，應(yīng)重新切割)。然后于酒精燈火焰底部的藍焰邊緣處將切口鈍化處理(即將管口于藍焰邊緣處做短暫灼燒，然后于顯微鏡下檢查管口形狀，如此反復(fù)，直至滿意)。如實驗室配有持卵管制作儀，則可在顯微鏡下直接監(jiān)視熱燈絲對持卵管管口灼燒后的形狀，及時調(diào)整二者之間的相對位置，更易得到滿意的持卵管。持卵管應(yīng)該做調(diào)整，用熔斷儀將其打彎使其末端成15度(不同的顯微注射儀度數(shù)可能有差異,打彎成25度左右,一般為20-25度)輕微彎曲以方便使用。此持卵管為不含細絲的玻璃，顯微鏡下用含刻度目鏡確定持卵管的外徑應(yīng)該為100-140?m。持卵管的內(nèi)徑很重要,可用鉑金燈絲灼燒管口,使其內(nèi)徑為30-50?m左右,內(nèi)徑要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管內(nèi)。為便于操作，持卵管可進一步調(diào)整使其末端輕微彎曲（15度）。洗卵管制作1） 點燃酒精燈，調(diào)節(jié)火焰到最佳。捏持玻璃毛細吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋轉(zhuǎn)過火。2） 當(dāng)吸管開始變軟，快速撤離火焰，向外急劇扯拉使吸管變長，形成口徑大約200?l的吸管。注意制備過程中離開火焰的時間以及扯拉的力度，盡量保證制備吸管的一致性。3） 為吸管評分，輕柔地折斷吸管，辨別其聲音是否清脆，或扯拉吸管或只做彎曲直到兩根同分數(shù)的吸管斷裂為止。4） 解剖鏡下(要在熔斷儀上)檢查吸管，并對其進行調(diào)整，確定其口徑以及管口光滑平整。移卵管的制作用于轉(zhuǎn)移注射后受精卵到假孕鼠體內(nèi)的吸管制作過程同上洗卵管。不同的是，這些吸管的口徑稍微小一些，大約150?m(150-160?m)，直徑比單受精卵的口徑略大一些，將促使卵細胞精細的充滿移卵管并轉(zhuǎn)移到輸卵管。移卵管在打磨過程中要求管口更光滑平整以減輕插入輸卵管時對輸卵管的損傷，同時必須注意移卵管頭在火焰上時間不可太長，防止融化堵塞。管口要平且要鈍化。凹玻片的準備必須準備適合承載用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培養(yǎng)皿做注射槽，載玻片上的受精卵應(yīng)該浸潤在pH緩沖工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保護。具體凹玻片的準備程序如下：1） 在超凈臺內(nèi)利用手動移液器將M2溶液加入凹玻片窩的基底部形成直徑大約0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液體的折射效應(yīng)。吸取胚胎實驗用礦物油于M2溶液上，礦物油的量以剛剛達M2溶液最高液面為宜，將凹玻片置于倒置顯微鏡的載物臺上，在低倍鏡下調(diào)節(jié)焦距，使M2溶液液滴的底面清楚為止。2） 覆蓋礦物油的作用：防止液滴脫水以及濃縮；使受精卵處于無菌狀態(tài)；固定M2溶液液滴。3） 從孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗滌2-3次，調(diào)整實驗用量，將其置于凹玻片的M2溶液中，調(diào)焦使在低倍鏡下清楚地看到受精卵的輪廓，并且保證受精卵有足夠空間自由移動，用持卵器將卵匯聚到一起，移卵時注意不要將氣泡移入，影響操作視野。顯微注射設(shè)備顯微注射儀的基本工作原理是運用立體倒置相差顯微鏡進行觀察監(jiān)測，顯微鏡兩側(cè)各置一臺顯微操作儀，一側(cè)接持卵管，另一側(cè)接注射針，可調(diào)節(jié)持卵管或注射針的空間位置。持卵管通過塑料管連接一個裝滿礦物油的帶微調(diào)的注射器，通過調(diào)節(jié)壓力控制卵的運動。注射針通過塑料管連接有壓力泵的注射儀。將注射時間與壓力固定后，進行注射操作。操作系統(tǒng)有LEICA AS TP基因轉(zhuǎn)殖操作系統(tǒng)（major instruments.co.Ltd）等，具體操作程序按其說明書嚴格進行。（3）注射針內(nèi)DNA的裝載把注射針的鈍性頭浸在盛待注射DNA的管中，溶液通過毛細吸管的虹吸作用進入注射針。注射針的末端應(yīng)該一直留在DNA溶液中直到注射針末端有小泡形成。這說明DNA溶液裝載完畢。仔細檢查注射針針頭末端，距其幾毫米處可見一個小凹液面。最后可將載滿DNA溶液的吸管裝在持針器或固定在器械環(huán)中待用。（4）受精卵的顯微注射受精卵的顯微注射過程相對簡單，制作大量樣品過程中，為保證顯微注射量的一致性，必須通過大量反復(fù)有效的練習(xí)才可以成功。1） 置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。2） 調(diào)節(jié)持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡（32X）下時位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。3） 挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見DNA溶液泡在油內(nèi)形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。4） 如果未見DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開注射器針頭。針頭重新進入油內(nèi)確定DNA溶液流的存在。5） 移動持卵管回到受精卵下部。通過微分驅(qū)動水壓控制系統(tǒng)使持卵管內(nèi)產(chǎn)生溫和的負壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過緊，否則會使卵變形，甚至?xí)⒙盐顺致哑鲀?nèi)。6） 對持卵管內(nèi)真空進行緩慢調(diào)節(jié)，使持卵管內(nèi)受精卵輕柔地旋轉(zhuǎn)，使卵內(nèi)原核位于持卵管口的遠側(cè)端。7） 維持持卵管穩(wěn)定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進行調(diào)節(jié)并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細胞外膜，前核核膜，進入核膜內(nèi)，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當(dāng)有彈性，應(yīng)用不同的方法進行嘗試突破此結(jié)構(gòu)。操作時避免與核接觸損傷核仁。8） 保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過程中可能出現(xiàn)的現(xiàn)象如下： 注射后原核將膨大到原來的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。 一氣泡出現(xiàn)在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒有被刺破，此時需繼續(xù)向內(nèi)進針，直到尖端進入核，同時要小心注射針尖端極易破損。 注射針壓力較大，看不到任何現(xiàn)象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。 若見胞質(zhì)顆粒涌出到卵黃周圍空間，說明受精卵破裂。注射過程中，發(fā)現(xiàn)卵破裂數(shù)目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射510枚卵。9） 用持卵器移動受精卵到凹玻片凹內(nèi)相對隔離的位置，以區(qū)分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進行下一組操作。5受精卵的輸卵管轉(zhuǎn)移（1）受精卵的輸卵管注射1）將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預(yù)先在手術(shù)部位剔除毛發(fā)。2）將受精卵從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至工作液內(nèi)。因受精卵在轉(zhuǎn)移過程中在孵箱外操作，所以應(yīng)該將其從培養(yǎng)基中移到工作液中。4） 用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對輸卵管轉(zhuǎn)移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當(dāng)?shù)墓ぷ饕海o接著在吸取另外一個小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當(dāng)所有的卵被負載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取最終容量的工作液。氣泡將有利于對壓力進行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動。5） 手術(shù)暴露輸卵管復(fù)合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關(guān)節(jié)之間作橫行切口。仔細用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發(fā)。捏住一側(cè)切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見。這時可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當(dāng)位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當(dāng)重新布置其位置。6） 輕輕移動塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當(dāng)調(diào)節(jié)顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見。7） 用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應(yīng)用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。8） 一旦漏斗部清晰可見，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。9） 在壓力可調(diào)節(jié)的前提下，輕輕把卵吸吹進入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時可稍微后撤移卵管再進行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應(yīng)該吹出細胞在培養(yǎng)皿中，重新吸卵。10） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內(nèi)。10）縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開。11）若進行雙側(cè)手術(shù)，則于另一側(cè)子宮角重復(fù)上述操作。12）手術(shù)完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態(tài)下，小型哺乳動物無法有效維持機體溫度。所以應(yīng)該注意小鼠的保溫?？梢杂脽釅|保持其溫度直到動物蘇醒。所有的動物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)或食子，所以對受體母鼠必須嚴格監(jiān)護。（2）注射后期監(jiān)護：手術(shù)后嚴格監(jiān)護防止并發(fā)癥的發(fā)生非常重要。麻醉易誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)血壓升高，所以手術(shù)后必須嚴密監(jiān)護至少2小時，同時推薦進行保溫處理。處于麻醉狀態(tài)的小鼠應(yīng)該用軟紗布包裹，而且籠中加墊草墊以及軟材料，并保持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動物處于麻醉狀態(tài)的時間。手術(shù)后小鼠常規(guī)4-5天觀察一次以