取小鼠腦組織.docx

丁香園上面總結(jié)的方法，排版有點(diǎn)亂。其實(shí)過程與大鼠近似，我的經(jīng)驗(yàn)是：1.材料準(zhǔn)備；大剪刀、眼科剪、眼科鑷、大鑷子、濾紙、竹簽等；2.步驟：處死小鼠，取頭顱；剪開皮膚，漏出顱骨；用大尖鑷子夾住兩側(cè)眼眶，用眼科剪稍剪除顱骨中線；再用眼科鑷夾住顱骨從內(nèi)向外夾，從下向上逐步去除顱骨；當(dāng)全腦露出時(shí)，再用眼科鑷去除腦膜和血管；然后用竹簽從嗅球處向下取出全腦，即可。3.注意事項(xiàng)：用力輕柔，否則容易弄破腦部；用剪刀剪顱骨時(shí)，一定要貼壁向上剪，否則容易剪破腦部；去除腦膜時(shí)，不能硬拉，否則容易弄破大腦；取出全腦時(shí)應(yīng)把頭頂朝下，用竹簽輕輕取出，離桌面也不要太遠(yuǎn)、高；若留病理，建議一定要取完整無損的大腦。 做免疫組化的話，稍微麻煩一點(diǎn)兒，因?yàn)槟X組織含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠剪開胸腔，找到心臟，從心尖入針，剪開右心耳先用生理鹽水灌注直到從心耳流出來的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的2535g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具體步驟：常規(guī)麻醉小鼠，將其固定，用剪刀剪開胸部皮膚，暴露出皮下組織，剪開時(shí)注意鈍性分離，以免誤傷。然后用鑷子提起劍突，用剪刀剪開胸腔，剪斷兩側(cè)肋骨，暴露整個(gè)胸腔，小心誤傷肺及心臟、大血管。用鑷子撕開心包膜，暴露心臟，用眼科剪剪開右心耳，然后提起心尖將準(zhǔn)備好的生理鹽水注射器插入左心室，注射，注射時(shí)小心針頭滑脫。生理鹽水灌流至肺和肝的顏色都變成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，針孔最好是同一個(gè)，多聚灌流時(shí)小鼠四肢會(huì)抽搐，待抽搐結(jié)束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在頸部離斷頭顱，用剪刀在小鼠頭顱中間皮膚剪一刀，將兩邊皮膚向下翻用手捏住，暴露整個(gè)顱骨，用眼科剪從脊髓端插入椎孔，沿著顱正中線剪開顱骨，注意剪刀向上翹一些，以免誤傷腦組織，剪開后用彎眼科鑷分離顱骨，小心分離，直至暴露整個(gè)大腦，然后用彎鑷伸入顱底離斷顱底神經(jīng)，就可以取出整個(gè)腦子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。具體操作如下：實(shí)驗(yàn)操作步驟：1)小鼠稱重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥鈉劑量的實(shí)施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。2)將麻醉的小鼠仰放在操作臺(tái)上，去毛。3)解剖小鼠，暴露心臟。4)找到心尖部，左手用鑷子提起心尖部，右手或左手將灌流針刺破心尖部進(jìn)針約 0.5cm（最好是用小點(diǎn)的針頭，用止血鉗固定針尖，剪開右心耳。5)將灌流器的導(dǎo)管部開口放到生理鹽水中里，打開灌流器灌流，直到從右心耳流出的液體為無色，同時(shí)小鼠肝臟色淡，腸管腫脹為止，停止灌流。沒有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。6)將灌流器的導(dǎo)管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要產(chǎn)生氣泡，開始灌流。此時(shí)如果看到小鼠四肢突然緊張，尾部卷曲，說明達(dá)到固定效果。7)灌流大約5分鐘，灌流液用量約150毫升左右結(jié)束。（小鼠的用量沒這么多）8）取材。取實(shí)驗(yàn)所需的標(biāo)本。9）將取出的材料放到事先準(zhǔn)備的多聚甲醛（戊二醛）中固定24小時(shí)后移至30%蔗糖中4度冰箱保存過夜。我們實(shí)驗(yàn)室鼠腦冰凍切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml經(jīng)左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰凍切片機(jī)，我們的leica1900的，不知道lz那里有沒有這個(gè)機(jī)子，還有一種原始的自己刷凍臺(tái)的那種，比較麻煩，切片厚度大概選擇20-40um差不多開胸時(shí)要把肋骨提起，大U字剪開左右肋弓后掀起，血管鉗固定一下（以免擋遮視野）；平頭針插入后稍許打開輸液器開關(guān)并迅速剪開充盈的右心耳（可見血涌出），用血管鉗將心室和平頭針一起鉗夾固定再推（但滴速也不能太快以免血管被沖破，使灌流液流進(jìn)肺里）。另：開胸時(shí)動(dòng)作盡量要快；針頭可以不插入主動(dòng)脈，留置于左室也行。試劑名稱：4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉所需藥品及劑量：A液：多聚甲醛40g 蒸餾水400ml B液：Na2HPO42H2O6.88g 蒸餾水300ml C液：NaOH3.86g 蒸餾水200m操作過程：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.27.4，最后，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml充分混合應(yīng)用范圍：光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛保存期限及溫度：4冰箱保存?zhèn)溆?，長期保存我在很多方面是個(gè)新手，經(jīng)常在園子里逛，學(xué)到了很多東西，但同時(shí)也看到了關(guān)于同一個(gè)問題有很多不同的回答，我想結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)，希望各位老師能就我提出的問題說說自己的經(jīng)驗(yàn)看法，給我啟示，因?yàn)楹芏嘧约何醋鲞^，怕自己哪里操作不恰當(dāng)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，非常感謝各位老師的不啻賜教！首先，我做的是大鼠（體重約230-250g），模型是大腦中動(dòng)脈栓塞，在不同的時(shí)間點(diǎn)取腦標(biāo)本，準(zhǔn)備做熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和冰凍切片，我提的問題主要是在于腦標(biāo)本的取和存方面。問題如下：熒光實(shí)時(shí)定量PCR方面：1、標(biāo)本需要灌注么，有戰(zhàn)友說不需要，你是怎么做的，有灌注的話什么溶液灌注，溫度？2、標(biāo)本取下后液氮速凍，然后轉(zhuǎn)-80度冰箱，這樣保存一般可以多久？3、抽提后的中RNA放-80度冰箱會(huì)很容易降解么，還是說要放液氮？Western blot方面：4、標(biāo)本用什么溶液灌注，溫度？5、同一個(gè)標(biāo)本可以同時(shí)用于RT-PCR和Western blot檢測么？（如果灌注手段一樣的話）冰凍切片方面：6、灌注沖血用什么溶液，溫度？7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常時(shí)間？多少毫升？8、4%多聚甲醛后固定時(shí)間是多久為宜？9、蔗糖梯度脫水，蔗糖是用什么配置的，PBS還是PB，濃度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每種濃度里沉底后就換另一種還是？10、我試做過一次，做法為：常規(guī)多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定過夜，然后30%的蔗糖脫水，這些都是用0.1M的PBS配的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖脫水3天了都還沒沉底（中間換過一次蔗糖溶液）。有戰(zhàn)友提議可以切幾塊后脫水效果會(huì)更好，如果你有跟我做一樣的模型標(biāo)本，你是怎么處理的，如何切？11、還有什么需要注意的地方或tips。灌注沖血用什么溶液，溫度？用的是含有肝素鈉的生理鹽水。每瓶500ml的生理鹽水加入80mg的肝素鈉，肝素鈉要避光保存，而且必須使用前臨時(shí)加入到生理鹽水中。肝素鈉生理鹽水需要用4度預(yù)冷。我們用注射器推，大概推100ml，10min。就可以將血液沖干凈。速度要自己掌握。每支肝素鈉每亳升含12500U，相當(dāng)于100mg，用20ml生理鹽水稀釋，分裝成40支，消毒備用（4貯存）。臨用時(shí)，注射器吸取肝素鈉溶液一支，而后將肝素液來回抽動(dòng)，使針筒局部濕潤，多余肝素液全部排出棄之，注射器內(nèi)死腔殘留的肝素液即可抗凝。純的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100個(gè)國際單位，10個(gè)國際單位能抗凝1ml血液計(jì)）。如果肝素的純度不高，或過期，所用的劑量應(yīng)增大23倍。用于試管內(nèi)抗凝時(shí)，一般可配成1%肝素生理鹽水溶液，取0.1ml加入試管內(nèi)，加熱80烘干，每管能使510 ml血液不凝固。作全身抗凝時(shí)，一般劑量為：大鼠2.53 mg(200300g體重)-1,兔或貓10 mgkg-1,狗510 mgkg-1。如果肝素的純度不高，或過期，所用的劑量應(yīng)增大23倍。7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常時(shí)間？多少毫升？一般多聚甲醛灌注20min，100ml。標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物的尾巴會(huì)甩動(dòng)，全身四肢收縮（這是因?yàn)榈鞍鬃冃运拢?，一般看起來像?dòng)物活過來了一樣。隨后就可以將動(dòng)物的頭斷掉，來取腦了。8、4%多聚甲醛后固定時(shí)間是多久為宜？這個(gè)不一定。對(duì)于石蠟切片，可以固定很久。但是對(duì)于冰凍切片，估計(jì)是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出來，將不需要的大腦組織切掉，比如腦干、小腦等等。擦干，放在蔗糖溶液里。9、蔗糖梯度脫水，蔗糖是用什么配置的，PBS還是PB，濃度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每種濃度里沉底后就換另一種還是？蔗糖用0.1M的PB配置。我一般配20%和30%兩個(gè)濃度。我個(gè)人感覺每個(gè)濃度需要沉糖48h。至少我發(fā)現(xiàn)24h是不夠的。沉糖必須完全沉底。10、我試做過一次，做法為：常規(guī)多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定過夜，然后30%的蔗糖脫水，這些都是用0.1M的PBS配的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖脫水3天了都還沒沉底（中間換過一次蔗糖溶液）。有戰(zhàn)友提議可以切幾塊后脫水效果會(huì)更好，如果你有跟我做一樣的模型標(biāo)本，你是怎么處理的，如何切？我不知道你是看哪個(gè)部位的表達(dá)。如果是海馬的話，我建議從前囟-1.40mm到前囟-6.30mm左右。確實(shí)提的問題很多，看樣子還是有所思考，值得贊揚(yáng)，我也只能說出我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，講幾個(gè)大概的原則，具體細(xì)節(jié)還要你自己在實(shí)驗(yàn)中體會(huì)。RT-PCE與WB都是分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，可以共用一個(gè)標(biāo)本，一般不需要灌注，文獻(xiàn)上都如此，需要新鮮的腦組織，液氮速凍，-80度保存，半年應(yīng)該沒問題，既然是MCA栓塞，那就要取MCA供血區(qū)域，嗅極后3-9mm，如果要分半暗帶，園子里有類似的帖子，可查找。至于不灌注，存留的血液可能會(huì)影響結(jié)果，我一般斷頭后用生理鹽水把血液沖洗干凈，然后再敲開露骨取腦，這樣，效果會(huì)好些。至于你的腦組織灌注固定，蔗糖脫水3天還沒沉底，可能與腦組織太大及梯度脫水有關(guān)，我一般在脫水前用雙面刀片沿冠狀面將多余的腦組織休掉，20%蔗糖1天，30%蔗糖2天，總共3天就足夠了，希望對(duì)你有幫助。你在斷頭后用生理鹽水把血液沖洗干凈，然后再敲開露骨取腦，我想沒通過灌注應(yīng)該沒辦法沖掉腦內(nèi)血管的血吧？我現(xiàn)在取RT-PCR和WB的標(biāo)本的做法是：用臨床上用的靜脈留置針（相對(duì)會(huì)比較粗些，而且質(zhì)軟不會(huì)刺破血管）插到升主動(dòng)脈快速灌注冰PBS 50ml左右（一般1分鐘內(nèi)灌完），然后快速取腦放入液氮速凍，盡量縮短時(shí)間，不知這種做法是否尚可？（個(gè)人覺得灌注后的腦標(biāo)本相對(duì)未灌注的會(huì)好取些，視野感覺也更好，不會(huì)血淋淋的）至于冰凍切片標(biāo)本的灌注固定已經(jīng)是按照你和甲醛版主的方法去做了，期待會(huì)有好的結(jié)果。我也說兩句冰凍切片，灌注用生理鹽水還是PBS這個(gè)問題不是主要問題，主要作用在于你能否沖干凈血管內(nèi)的血液，而且一般觀點(diǎn)認(rèn)為灌注液最好在10分鐘之內(nèi)沖完（原因可能在于缺血后腦細(xì)胞在10分鐘后會(huì)大量死亡），而且灌注液最好不要用冰凍的（原因有時(shí)候冰凍的液體也會(huì)使老鼠抽搐，造成你的判斷失誤）沖洗液的速度越快越好，量要適當(dāng)控制，過量的話細(xì)胞會(huì)腫大，一般我們以肝臟變白為標(biāo)準(zhǔn)，如果還不放心的話，再稍微延長點(diǎn)時(shí)間，但是最好不要超過10分鐘。灌注時(shí)，有一點(diǎn)小技巧，就是把心臟稍微往大鼠的右邊向上扭一點(diǎn)，以進(jìn)針沒有阻滯感為佳。后固定我認(rèn)為時(shí)間不宜太長，因?yàn)檫^多的甲醛會(huì)增加片子的背景顏色。一般以6到12小時(shí)為佳。還有一種方法就是當(dāng)你的老鼠灌注的不好時(shí)，可以后固定以及脫水兩個(gè)步驟一起進(jìn)行。這是別人介紹的，個(gè)人沒有試過。脫水我們一般是30%的蔗糖水（pbs配置）等它沉底了就可以切了。脫水不好的話會(huì)使片子出現(xiàn)冰晶。該切片了，其實(shí)切片時(shí)冰凍的過程是最容易出現(xiàn)冰晶的，我解決的辦法比較簡單就是速凍，讓標(biāo)本快速的變白。但是問題也不要太低了，太低的話容易碎片，一般在-20左右，腦組織的話最好不要低于-35度。另外大家可有去找找萊卡CM1850的冰凍切片機(jī)說明書，里面有詳細(xì)的介紹切片過程。其它類型的切片機(jī)我想原理也應(yīng)當(dāng)差不多。弄明白了一臺(tái)其它的也就相應(yīng)的熟悉了。冰凍切片方面：灌注沖血可以用生理鹽水、0.1M的PB 0.01M的PBS都可以（注意調(diào)pH值）。我們實(shí)驗(yàn)室灌注的時(shí)候用常溫的，我們認(rèn)為冷的會(huì)引起血管收縮?？焖?zèng)_到肝臟變白或者右心耳流出的液體變白為止。多聚甲醛灌注固定速度先快后慢。灌得好就會(huì)看到老鼠抽搐、四肢變硬。如果只取腦，可以夾住腹主動(dòng)脈，這樣灌注固定的快，而且省液體。我們后固定和沉糖都在4度進(jìn)行。4%多聚甲醛和蔗糖溶液也是4度保存。關(guān)于多聚甲醛灌注以后，確實(shí)對(duì)于石蠟切片可以固定很久，但是如果做組化的話，一般都是24小時(shí)，時(shí)間長的話，比如超過1周，可能抗原就會(huì)丟失，不容易出結(jié)果。對(duì)于大腦：灌注取腦后是繼續(xù)放到4度多聚甲醛進(jìn)行24小時(shí)后固定，24h之后進(jìn)行蔗糖梯度脫水，那么下一步的保存，假如2天后已經(jīng)沉底。因?yàn)闆]有做過大腦，所以我的問題是：第一：蔗糖溶液是否需要和多聚甲醛溶液一樣一般是20倍體積于組織？第二：這個(gè)時(shí)候的腦組織是否是和石蠟塊里的腦組織一樣，保存時(shí)間可以很長，會(huì)不會(huì)很快出現(xiàn)抗原丟失的問題。第三：保存的條件是什么，石蠟塊可以室溫，最好4度，甚至-20度。但是其外面包有石蠟。而大腦還是裸體的，我見到多用O