芽孢桿菌XXXXXX抗稻瘟活性物質(zhì)發(fā)酵.doc

X X X X大 學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)(論文)作 者:學(xué) 號(hào)：學(xué)院(系):專(zhuān) 業(yè):生物工程題 目:芽孢桿菌XXXXXX抗稻瘟活性物質(zhì)發(fā)酵條件的研究教授 指導(dǎo)者： (姓 名) (專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù))評(píng)閱者： (姓 名) (專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù)) 2009年 6月畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文）中文摘要 本試驗(yàn)以芽孢桿菌XXXXXX發(fā)酵液抑菌活性為主要指標(biāo),研究了發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源營(yíng)養(yǎng)因子,以及接種量、裝液量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速、溫度等非營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)XXXXXX發(fā)酵液生物活性的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，XXXXXX菌最適宜的發(fā)酵條件是pH 為8、接種量體積分?jǐn)?shù)2%、發(fā)酵溫度28、搖床轉(zhuǎn)速210r/min。不同的裝液量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)XXXXXX發(fā)酵液的抗稻瘟活性并沒(méi)有影響。采用合成培養(yǎng)基，氮源為硝酸鈉時(shí)，XXXXXX菌的抗稻瘟活性?xún)?yōu)于其它氮源。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株XXXXXX優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方：可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，pH為7。關(guān)鍵詞 稻瘟菌 發(fā)酵條件 芽孢桿菌XXXXXX 正交設(shè)計(jì)畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文）外文摘要Title Effects of Culture Conditions on anti-Rice Blast fungus by Bacillus XXXXXX AbstractThe effects of the nutritional factors,inoculation rate,medium capacity, initial pH,fermentation time,rotate speed and fermentation temperature on biological activity of Bacillus XXXXXX were investigated by detecting the inhibition rate of rice blast fungus in the study.The result showed that the optimum fermentation conditions of XXXXXX included pH 8,inoculation rate 2%(v/v),fermentation temperature 28,rotate speed 210r/min.As to different fermentation time and medium capacity,the inhibitory effects of XXXXXX on rice blast fungus showed no different.When the nitrogen source was sodium nitrate,XXXXXX showed a stronger inhibitory ability than that the nitrogen source was yeast extract or peptone on synthetic medium. Orthogonal test showed that the optimum medium of XXXXXX fermentation was starch 3%,NaNO4 0.25%,KH2PO4 0.1%,pH 7.Keywords rice blast fungus; fermentation conditions; Bacillus XXXXXX; orthogonal design 本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文） 第 23 頁(yè) 共 28頁(yè)目 錄1 引言11.1 稻瘟菌概述11.2 生物農(nóng)藥11.2.1 生物體農(nóng)藥21.2.2 生物化學(xué)農(nóng)藥21.2.3 生物農(nóng)藥發(fā)展前景31.3 發(fā)酵工藝控制31.3.1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響31.3.2 pH對(duì)發(fā)酵的影響41.3.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響41.3.4 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響41.3.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響41.3.6 裝液量對(duì)發(fā)酵的影響51.4 正交設(shè)計(jì)及其統(tǒng)計(jì)分析51.4.1 正交設(shè)計(jì)概述51.4.2 正交表及其特點(diǎn)51.5 本研究的目的及意義62 材料和方法62.1 材料62.1.1 菌種62.1.2 儀器設(shè)備62.1.3 試劑藥品72.1.4 培養(yǎng)基72.2 方法72.2.1 菌種保存72.2.2 菌種復(fù)活72.2.3土豆液制備72.2.4 種子液制備72.2.5 活性檢測(cè)72.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵條件對(duì)活性的影響82.2.7 正交試驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基83 結(jié)果93.1 單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵條件對(duì)活性的影響93.1.1 pH對(duì)發(fā)酵液活性的影響93.1.2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響103.1.3 時(shí)間對(duì)發(fā)酵液活性的影響113.1.4 裝液量對(duì)發(fā)酵液活性的影響133.1.5 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液活性的影響143.1.6 接種量對(duì)發(fā)酵液活性的影響153.1.7 氮源對(duì)發(fā)酵液活性的影響163.2 正交設(shè)計(jì)確定最優(yōu)化培養(yǎng)基18結(jié) 論20致 謝21參考文獻(xiàn)22表 1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方案8表 2 正交組合試驗(yàn)結(jié)果18圖 1 不同pH條件下的抑菌圈9圖 2 pH對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響10圖 3 不同溫度條件下的抑菌圈11圖 4 溫度對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響11圖 5 不同發(fā)酵時(shí)間的抑菌圈12圖 6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響12圖 7 不同裝液量條件下的抑菌圈13圖 8 裝液量對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響13圖 9 不同轉(zhuǎn)速條件下的抑菌圈14圖 10 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響15圖 11 不同接種量條件下的抑菌圈15圖 12 接種量對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響16圖 13 不同氮源條件下的抑菌圈17圖 14 氮源對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響17圖 15 四因素與NUST菌株產(chǎn)抗的關(guān)系191 引言1.1 稻瘟菌概述水稻稻瘟病(Blast Fungus)，是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一，義名稻熱病，俗稱(chēng)火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等，由稻梨孢菌（PyiculariaoryzaeCav.）引起。該病一年四季均可對(duì)水稻造成危害，其危害遍及水稻的各個(gè)部位，有苗稻瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié)稻瘟、穗頸瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等1。稻瘟病菌主要在稻草上和稻種上越冬，菌絲發(fā)育的溫度為837攝氏度，以2428攝氏度最適合；分生孢子在1035攝氏度之間都可形成和發(fā)芽，經(jīng)過(guò)46天便發(fā)育長(zhǎng)大。分生孢子很輕，以空氣為主要傳播途徑，一落到水稻上，只要得到一點(diǎn)水份都可成活，鉆到水稻體內(nèi)，便會(huì)破壞細(xì)胞，吸收養(yǎng)份。它鉆入的地方，便可看到病斑，病斑再產(chǎn)生分生孢子，又傳播到其它植株上，危害其它的植株。水稻在分蘗期和孕穗期抵抗力差，極易被感染。它的生長(zhǎng)由天氣、肥水管理、品種的抗性三大因素構(gòu)成。從天氣上講，溫度在2030度，相對(duì)溫度在80%90%最適合病菌孢子發(fā)育和傳播；肥水管理上講，肥水管理也很密切，如偏施氨肥或肥料用量過(guò)大、施肥的時(shí)間等形成稻瘟病菌生長(zhǎng)的有利條件。美國(guó)科學(xué)家在2005年4月21日出版的自然雜志上公布了常見(jiàn)的稻瘟病菌的基因組草圖，這是科學(xué)家首次完成植物病原體的基因測(cè)序。美國(guó)北卡羅來(lái)納州立大學(xué)科學(xué)家報(bào)告說(shuō)，測(cè)序結(jié)果表明稻瘟病菌的基因超過(guò)1.1萬(wàn)個(gè)。另外，他們發(fā)現(xiàn)這種真菌的孢子上存在一個(gè)受體，這種受體能夠區(qū)別水稻和其他作物?？茖W(xué)家說(shuō)，該受體的發(fā)現(xiàn)在抗擊這種病菌的道路上邁出了一大步?？茖W(xué)家可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法對(duì)水稻進(jìn)行改良，使其不被受體識(shí)別。水稻稻瘟病的研究已有100余年的歷史，我國(guó)早在1925年就開(kāi)始調(diào)查研究，70余年來(lái)，在水稻種質(zhì)資源的抗性鑒定、篩選和利用，抗瘟良種的選育、病菌生理小種、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和綜合防治等方面取得了顯著的進(jìn)展2。但由于品種的更替，氣候的變化，栽培耕作制度的改革，以及病菌小種組成的變化等因素的綜合影響，稻瘟病的發(fā)生和危害仍然是當(dāng)今世界各稻區(qū)面臨的難題，抗病良種在推廣35年后，病菌常產(chǎn)生能侵染該品種的優(yōu)勢(shì)小種，從而引起抗性喪失。隨著品種的單一化和品種抗性的“喪失”，往往出現(xiàn)流行，造成嚴(yán)重?fù)p失。1.2 生物農(nóng)藥生物農(nóng)藥是“可用來(lái)防治病、蟲(chóng)、草等有害生物的生物體本身及源于生物，并可作為農(nóng)藥的各種生理活性物質(zhì)”。按上述定義，生物農(nóng)藥應(yīng)包括生物體農(nóng)藥和生物化學(xué)農(nóng)藥。生物體農(nóng)藥是指用來(lái)防除病、蟲(chóng)、草等有害生物的商品活體生物，生物化學(xué)農(nóng)藥則是指從生物體中分離出的具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)有害生物有控制作用的生物活性物質(zhì)3。1.2.1 生物體農(nóng)藥生物體農(nóng)藥包括植物體農(nóng)藥、動(dòng)物體農(nóng)藥和微生物體農(nóng)藥3大類(lèi)。1.2.1.1植物體農(nóng)藥4植物體農(nóng)藥是利用作物本身為載體，經(jīng)基因修飾或重組而開(kāi)發(fā)為農(nóng)藥。1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世，1986年美國(guó)EPA 首次批準(zhǔn)孟山都公司的轉(zhuǎn)基因作物如抗蟲(chóng)棉、大豆和抗草甘膦玉米進(jìn)行試驗(yàn),1994年準(zhǔn)許其商品化生產(chǎn)，并首次將之列入農(nóng)藥范疇。1.2.1.2動(dòng)物體農(nóng)藥動(dòng)物體農(nóng)藥主要是指商品化的天敵昆蟲(chóng)和捕食螨，以及采用物理或生物技術(shù)改造的昆蟲(chóng)等。在早期的生物防治中，最重要的措施就是利用天敵昆蟲(chóng)和捕食螨。捕食性天敵分屬于8個(gè)目的200個(gè)科內(nèi)，常用的種類(lèi)有瓢蟲(chóng)、草蛉、胡蜂等。1.2.1.3微生物體農(nóng)藥微生物體農(nóng)藥是指用來(lái)防治有害生物的活體微生物。細(xì)菌類(lèi)農(nóng)藥制劑有Bt(蘇云金桿菌)、亞寶(枯草桿菌)、力寶(假單胞桿菌)、增產(chǎn)菌(蠟狀芽孢桿菌)等。近年來(lái)，采用基因工程等高新技術(shù)獲得了Bt工程菌株，其毒力水平較出發(fā)菌株提高了1.54.3倍口，部分指標(biāo)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。一些害蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生了抗藥性，為了延緩其抗藥性的產(chǎn)生，應(yīng)用Bt制劑與阿維菌素、昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等復(fù)合增效的方式，成功研制了Bt生物復(fù)合殺蟲(chóng)劑抑蟲(chóng)啉和克蟲(chóng)威，其殺蟲(chóng)效果良好，使用成本大大降低。1.2.2 生物化學(xué)農(nóng)藥生物化學(xué)農(nóng)藥包括植物性生物化學(xué)農(nóng)藥、動(dòng)物性生物化學(xué)農(nóng)藥和微生物性生物化學(xué)農(nóng)藥3大類(lèi)6。1.2.2.1 植物性生物化學(xué)農(nóng)藥自20世紀(jì)80年代以來(lái)，植物性生化農(nóng)藥在我國(guó)發(fā)展很快，至今已成功地開(kāi)發(fā)出了許多植物性農(nóng)藥，煙堿等16種植物性農(nóng)藥已登記注冊(cè)，生產(chǎn)企業(yè)達(dá)46家。植物性殺蟲(chóng)劑主要是利用植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)如生物堿、萜烯類(lèi)、黃酮等來(lái)抑制害蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，干擾其正常行為。研究的內(nèi)容涉及到楝科、禾本科、衛(wèi)矛科、柏科、豆科、菊科、瑞香科等科的多種植物6。1.2.2.2 動(dòng)物性生物化學(xué)農(nóng)藥動(dòng)物性生化農(nóng)藥中最常見(jiàn)的為昆蟲(chóng)性信息素類(lèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)已合成昆蟲(chóng)性信息素l000多種，已商品化的有280多種。同時(shí)，對(duì)蚜蟲(chóng)的報(bào)警信息素、蜚蠊的聚集信息素和螞蟻的蹤跡信息素進(jìn)行了研究，并取得了較大的成果。1.2.2.3 微生物性生物化學(xué)農(nóng)藥微生物產(chǎn)生的抗生素和毒素如Avermectin、井岡霉素、雙丙氨磷、赤霉素、梅嶺霉素等可防治多種病、蟲(chóng)、草、螨，效果很好。1987年Barron等報(bào)道了一種真菌粗皮側(cè)耳菌絲產(chǎn)生的毒素可擊倒線(xiàn)蟲(chóng)，1992年從粗皮側(cè)耳中分離出一種殺線(xiàn)蟲(chóng)毒素transzecenedioic acid7。至今已發(fā)現(xiàn)9O余種殺線(xiàn)蟲(chóng)的真菌毒素，如擔(dān)子菌、子囊菌及其活性代謝物。梅嶺霉素對(duì)蘋(píng)果紅蜘蛛、柑橘紅蜘蛛、二斑葉螨有很好防效。1.2.3 生物農(nóng)藥發(fā)展前景對(duì)我國(guó)來(lái)說(shuō)，微生物性農(nóng)藥和植物性農(nóng)藥是生物農(nóng)藥發(fā)展的主體。當(dāng)前，微生物農(nóng)藥特別是Bt發(fā)展得到了大力扶持，Bt資源豐富，產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)便捷，與多種生物農(nóng)藥復(fù)合增效能力極強(qiáng)，并已開(kāi)發(fā)出用于防治農(nóng)作物(蔬菜、水稻、棉花等)、森林(含城市園林)和公共衛(wèi)生等方面主要害蟲(chóng)的系列產(chǎn)品，其殺蟲(chóng)潛力在蔬菜、水稻、棉花及經(jīng)濟(jì)林果主要害蟲(chóng)上逐漸得到發(fā)揮。因此，以Bt為依托研制開(kāi)發(fā)新型高效、低毒、低成本殺蟲(chóng)劑是一條徹底改變我國(guó)現(xiàn)存殺蟲(chóng)劑品種布局不合理的捷徑，也是短、平、快開(kāi)發(fā)國(guó)產(chǎn)農(nóng)藥品種并與國(guó)外農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)的重要手段8。1.3 發(fā)酵工藝控制微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要賦以合適的環(huán)境條件才能使它的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來(lái)。為此，我們必須通過(guò)各種方法了解有關(guān)生產(chǎn)菌種對(duì)環(huán)境因素的要求，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH、氧的需求等，并深入了解生產(chǎn)菌在合成產(chǎn)物過(guò)程中的代謝調(diào)控機(jī)制以及可能的代謝途徑，為設(shè)計(jì)合理的生產(chǎn)工藝提供理論基礎(chǔ)9。就產(chǎn)品的類(lèi)型而言，發(fā)酵有下列幾種主要類(lèi)型10：以微生物菌體為產(chǎn)物的微生物菌體發(fā)酵、以微生物酶（含蛋白）為產(chǎn)物的酶發(fā)酵、以菌體代謝產(chǎn)物（含初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物）為目的的產(chǎn)品發(fā)酵和利用微生物酶修飾作用的微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵等。1.3.1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響微生物能夠在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但是要獲得高質(zhì)量的發(fā)酵液，其最適溫度區(qū)間很狹窄。溫度的變化對(duì)發(fā)酵過(guò)程可產(chǎn)生兩方面的影響：一方面是影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)；另一方面是影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)11。產(chǎn)物的合成是由一系列的酶催化反應(yīng)來(lái)完成的。一般發(fā)酵溫度升高，酶反應(yīng)速率增大，發(fā)酵周期縮短。但酶本身又很容易過(guò)熱而失活，從而影響酶催化效率，最終降低產(chǎn)率。因此發(fā)酵產(chǎn)物的合成也有一個(gè)最適溫度。另外，溫度還會(huì)影響生物合成的方向。例如，四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素，在低于30下，合成金霉素的能力較強(qiáng)。合成四環(huán)素的比例隨溫度的升高而增大，在35下只產(chǎn)生四環(huán)素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)代謝有調(diào)節(jié)作用。在低于20時(shí)，氨基酸合成途徑終產(chǎn)物對(duì)第一個(gè)酶的反饋抑制作用比在正常生長(zhǎng)溫度37大。1.3.2 pH對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有非常明顯的影響，也是影響發(fā)酵過(guò)程中各種酶活動(dòng)的重要因素。由于pH不當(dāng)，可能?chē)?yán)重影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，因此對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)有各自的最適生長(zhǎng)pH。生長(zhǎng)在高pH（8.5-11.5）的微生物稱(chēng)為嗜堿菌；嗜酸菌是指那些生長(zhǎng)在低pH（0-5.5）中的微生物12。1.3.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響這是指移種的種子液體積與發(fā)酵液體積之比。不同微生物其發(fā)酵的接種量是不同的。接種量的大小是由該菌種在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖速度決定的。通常，采用較大的接種量可以縮短生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，是產(chǎn)物的合成提前。這是由于種子量多，種子液中含有大量的胞外水解酶類(lèi)，有利于基質(zhì)的利用，并且生產(chǎn)菌在整個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)迅速占優(yōu)勢(shì)，從而減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。但是，接種量過(guò)大，也可能使菌種生長(zhǎng)過(guò)快、培養(yǎng)液黏度增加，導(dǎo)致溶氧不足，影響產(chǎn)物合成13。1.3.4 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響在需氧發(fā)酵過(guò)程中，氣態(tài)氧必需先溶解于培養(yǎng)液中，然后才可能傳遞到細(xì)胞表面，再經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與菌體內(nèi)的氧化等生物化學(xué)反應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)室三角瓶發(fā)酵需要在搖床上進(jìn)行。控制轉(zhuǎn)速對(duì)于發(fā)酵來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)速太小，氧氣無(wú)法進(jìn)入發(fā)酵液中；轉(zhuǎn)速太快，分子氧無(wú)法與菌體充分接觸。1.3.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響當(dāng)一個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞接種于含有生長(zhǎng)所需基本成分的培養(yǎng)基時(shí)。細(xì)胞開(kāi)始累積營(yíng)養(yǎng)物，合成新的細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，細(xì)胞長(zhǎng)大，復(fù)制它的遺傳物質(zhì)，最后合成新的細(xì)胞壁和細(xì)胞分，一個(gè)細(xì)胞分裂變成兩個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)另外一段時(shí)間分裂變成四個(gè)細(xì)胞。細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中遵循典型模式規(guī)律生長(zhǎng)，細(xì)菌接種后立即有一個(gè)適應(yīng)培養(yǎng)基的階段稱(chēng)為延遲期，接著就是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以活細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間所作曲線(xiàn)，可以見(jiàn)到一小段直線(xiàn)，一旦營(yíng)養(yǎng)耗盡或有毒代謝物積累，細(xì)胞數(shù)目的凈增長(zhǎng)停止，稱(chēng)作穩(wěn)定期，再經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，緊接著是衰亡期，細(xì)胞數(shù)目下降，直到細(xì)胞裂解18。因此，發(fā)酵過(guò)程一定要在對(duì)數(shù)期即將結(jié)束的時(shí)候就停止。1.3.6 裝液量對(duì)發(fā)酵的影響裝液量的多少主要是影響發(fā)酵瓶?jī)?nèi)空氣量的多少。依據(jù)細(xì)菌的代謝類(lèi)型，它們對(duì)氧氣的要求變化很大。好氧菌為在有分子氧條件下才能生長(zhǎng)的細(xì)菌；厭氧菌為生長(zhǎng)不需要氧的細(xì)菌；在此范圍內(nèi)還有專(zhuān)性厭氧菌在有氧條件下致死。兼性厭氧菌如大腸桿菌，有氧情況下生長(zhǎng)的更好，無(wú)氧條件下也能生長(zhǎng)。1.4 正交設(shè)計(jì)及其統(tǒng)計(jì)分析1.4.1 正交設(shè)計(jì)概述正交設(shè)計(jì)(orthogonal design)是一種研究多因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法。在多因素試驗(yàn)中，隨著試驗(yàn)因素和水平數(shù)的增加，處理組合數(shù)急劇增加。例如，3因素3水平的試驗(yàn)，就有33=27個(gè)處理組合，4因素4水平的試驗(yàn)，就有44=256個(gè)處理組合。要全面實(shí)施這么龐大的試驗(yàn)室相當(dāng)困難的。因而，D.J.Finney 倡議了部分試驗(yàn)法。而后日本學(xué)者倡導(dǎo)利用征繳款式設(shè)計(jì)部分試驗(yàn)，稱(chēng)為正交試驗(yàn)14。正交試驗(yàn)利用一套規(guī)格化的表格正交表（orthogonal table）來(lái)科學(xué)合理地安排試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法。這種設(shè)計(jì)的特點(diǎn)是在全部試驗(yàn)處理組合中，挑選部分有代表性的水平組合（處理組合）進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)部分實(shí)施了解全面試驗(yàn)情況，從中找出較優(yōu)的處理組合。這樣可以大大節(jié)省人、財(cái)、物和時(shí)間，使一些難以實(shí)施的多因素試驗(yàn)得以實(shí)施。例如，要進(jìn)行一個(gè)4因素3水平的多因素試驗(yàn)，如果全面實(shí)施則需要34=81個(gè)處理組合，在試驗(yàn)中因規(guī)模太大而難以實(shí)施。但是，如果采用一張L9（34）的正交表安排試驗(yàn)，則只要9個(gè)處理組合就夠了。1.4.2 正交表及其特點(diǎn)正交表是正交設(shè)計(jì)的基本工具。在正交設(shè)計(jì)中，安排試驗(yàn)、分析結(jié)果，均在正交表上進(jìn)行。常用的正交表，已由數(shù)學(xué)工作者制定出來(lái)，試驗(yàn)時(shí)只要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件直接套用就行了，不需要另行編制15。用正交表進(jìn)行試驗(yàn)安排具有以下兩個(gè)特性：（1）均衡分散性：是說(shuō)明正交表挑出來(lái)的這部分水平組合，在全部可能的水平組合中分布均勻，因此代表性強(qiáng)，能較好地反映全面情況。（2）整齊可比性：由于正交表中個(gè)因素的水平是兩兩正交的，因此任一因素任一水平下都必須均衡的包含著其它因素的個(gè)水平。常用正交表中，適用于二水平試驗(yàn)的L4（23）、L8（27），適用于三水平試驗(yàn)的有L9（34）、L27（313）等，還有適用于四水平、五水平及水平數(shù)不等的正交表，共設(shè)計(jì)時(shí)選用。1.5 本研究的目的及意義本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)平板對(duì)峙法從土壤中分離出對(duì)水稻稻瘟病菌有拮抗作用的枯草芽孢桿菌XXXXXX。通過(guò)初步的研究發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)水稻稻瘟菌具有明顯的抑制作用。本課題擬分析影響XXXXXX的發(fā)酵因素，研究不同條件對(duì)該菌代謝產(chǎn)物活性的影響，為開(kāi)發(fā)抗稻瘟制劑確定最適的培養(yǎng)基。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 菌種XXXXXX是本實(shí)驗(yàn)室保存菌種；水稻稻瘟菌（Blast Fungus）是本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。2.1.2 儀器設(shè)備恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科技器材廠(chǎng)電子萬(wàn)用爐 天津泰斯特儀器廠(chǎng)電子天平 上海良年儀器儀表有限公司立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng) 特制加厚鋁鍋 淮南市大通區(qū)泰達(dá)鋁制品廠(chǎng)雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)全溫度光照震蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)高速微量離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司玻璃儀器烘干器 河南省鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng)2.1.3 試劑藥品無(wú)水氯化鈣，蔗糖，酵母膏，磷酸二氫鉀，氯化亞鐵，硫酸鎂，硝酸鈉，可溶性淀粉，蛋白胨，瓊脂。2.1.4 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：蔗糖2.0%，土豆20%，瓊脂 1.2%。種子培養(yǎng)基：蔗糖 2.0%，土豆 20%。發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆 20%。Ht培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀 0.1%，無(wú)水氯化鈣 0.01%，硫酸鎂 0.015%，氯化鐵 0.001%，可溶性淀粉 3%，硝酸鈉 0.25%，水50mL。2.2 方法2.2.1 菌種保存采用20%甘油保存菌種，即甘油:菌液=20:80,800uL菌液加200uL滅菌甘油后,充分混勻后,-70保藏。2.2.2 菌種復(fù)活將保存的XXXXXX菌株，用接種環(huán)接入含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28下培養(yǎng)24d。2.2.3土豆液制備將新鮮土豆去皮，稱(chēng)重，切成薄片，水煮加熱，待沸騰之后保持微沸狀態(tài)30min，冷卻，用雙層濾布過(guò)濾，并按照5：1的比例定容。2.2.4 種子液制備將活化好的菌種接種到種子液培養(yǎng)基中，在28、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h。2.2.5 活性檢測(cè)發(fā)酵液經(jīng)0. 45m微孔濾膜過(guò)濾滅菌后，取3mL過(guò)濾液與30mL冷卻至55左右的PDA培養(yǎng)基混合倒入已滅菌培養(yǎng)皿中，待凝固后，在培養(yǎng)基中央接種生長(zhǎng)旺盛的稻瘟病菌進(jìn)行拮抗性測(cè)定, 以無(wú)菌空白培養(yǎng)基作對(duì)照，28下培養(yǎng)57d。測(cè)量菌落直徑, 并計(jì)算相對(duì)抑菌率。相對(duì)抑菌率(%)=(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑100%或相對(duì)抑菌率(%)=拮抗帶寬度/對(duì)照菌落半徑100%2.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵條件對(duì)活性的影響2.2.6.1 pH對(duì)發(fā)酵液活性的影響16在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)至2、4、6、8、10、12、14，28、180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)30h，測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.6.2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響按2%接種量接種，分別在28、37下180 r/min振蕩培養(yǎng)30h，測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.6.3 時(shí)間對(duì)發(fā)酵液活性的影響17將培養(yǎng)好的種子液，按2%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28、180 r/min恒溫?fù)u床中分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、72h、96h，測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.6.4 裝液量對(duì)發(fā)酵液活性的影響18以搖瓶裝液量變化方式來(lái)進(jìn)行,在250mL三角瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基分別為25mL、50mL、75mL、100mL、125mL和150mL, 按2%接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28、180 r/min條件下培養(yǎng)30h,測(cè)定發(fā)酵液的抗稻瘟活性。2.2.6.5 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液活性的影響19按2%接種量接種,分別在28，210r/min、100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30h,測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.6.6 接種量對(duì)發(fā)酵液活性的影響20分別采用裝液量的1 %、2 %、5 %、7.5 %、10%、20%的接種量接種拮抗菌株XXXXXX于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 28、180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)30h,測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.6.7 氮源對(duì)發(fā)酵液活性的影響21在Ht培養(yǎng)基中分別添加1%的硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨作為氮源，接種后28、180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)30h,測(cè)定發(fā)酵液活性。2.2.7 正交試驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基選取可溶性淀粉、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、pH為主要發(fā)酵條件, 設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn), 見(jiàn)表2。配制培養(yǎng)基, 按不同發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)后,測(cè)定各發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌的拮抗性22-24。表 1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方案試驗(yàn)號(hào)（處理組合）1列：可溶性淀粉（A）2列：硝酸鈉（B）3列：磷酸二氫鉀（C）4列：pH（D）1234567891：0.5g1：0.5g1：0.5g2：1.5g2：1.5g2：1.5g3：2.5g3：2.5g3：2.5g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.05g3：0.1g2：0.05g3：0.1g1：03：0.1g1：02：0.05g1：42：73：103：101：42：72：73：101：43 結(jié)果3.1 單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵條件對(duì)活性的影響3.1.1 pH對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同pH條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖1所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖2所示。圖 1 不同pH條件下的抑菌圈注：a-2；b-4；c-6；d-8；e-10；f-12；g-14；h-對(duì)照?qǐng)D 2 pH對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響結(jié)果表明發(fā)酵液pH 值對(duì)拮抗菌株XXXXXX產(chǎn)生抗稻瘟物質(zhì)的抑菌活性關(guān)系密切,發(fā)酵液初始pH在8時(shí)代謝產(chǎn)物的活性最強(qiáng)；在微酸性或微堿性的環(huán)境中，發(fā)酵液對(duì)稻瘟菌的抑制作用較強(qiáng)；但是在過(guò)酸性（pH12）的環(huán)境中活性受到明顯的抑制。3.1.2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同溫度發(fā)酵條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖3所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖4所示。圖 3 不同溫度條件下的抑菌圈注：a-37；b-28；c-對(duì)照?qǐng)D 4 溫度對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，XXXXXX菌在28條件下培養(yǎng)得到的發(fā)酵液活性大于在37得到的發(fā)酵液。相對(duì)于對(duì)照組，28的發(fā)酵液的抑菌率為17%，而37的發(fā)酵液幾乎沒(méi)有活性。3.1.3 時(shí)間對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同發(fā)酵時(shí)間條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖5所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖6所示。圖 5 不同發(fā)酵時(shí)間的抑菌圈注：a-12h；b-24h；c-36h；d-48h；e-72h；f-96h；g-對(duì)照?qǐng)D 6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)XXXXXX菌發(fā)酵液的活性沒(méi)有明顯的影響。3.1.4 裝液量對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同裝液量條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖7所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖8所示。 圖 7 不同裝液量條件下的抑菌圈注：a-25mL；b-50mL；c-75mL；d-100mL；e-125mL；f-150mL；g-對(duì)照 圖 8 裝液量對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響研究發(fā)現(xiàn)，小于75mL 裝液量的發(fā)酵液的活性強(qiáng)于大于100mL裝液量，但是，差異并不顯著。3.1.5 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖9所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖10所示。 圖 9 不同轉(zhuǎn)速條件下的抑菌圈注：a-210r/min；b-100r/min；c-對(duì)照 圖 10 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，XXXXXX菌在不同的轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)得到的發(fā)酵液的活性具有明顯的差異，在轉(zhuǎn)速為210r/min的發(fā)酵液活性大于在100r/min轉(zhuǎn)速下得到的發(fā)酵液。相對(duì)于對(duì)照組，210r/min轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液的抑菌率達(dá)到40%；而在100r/min的轉(zhuǎn)速下，發(fā)酵液抑菌率僅為14%。3.1.6 接種量對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同接種量條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖11所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖12所示。 圖 11 不同接種量條件下的抑菌圈注：a-1%；b-2%；c-5%；d-7.5%；e-10%；f-20%；g-對(duì)照?qǐng)D 12 接種量對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響結(jié)果顯示，在接種量為2%時(shí)，發(fā)酵液的活性最強(qiáng)，其活性是10%接種量條件下的5倍左右。從整體上看，較小接種量條件下的發(fā)酵液活性普遍高于較大的接種量，說(shuō)明在接種量過(guò)高時(shí)，由于培養(yǎng)基內(nèi)菌體量過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，導(dǎo)致菌類(lèi)大量死亡，產(chǎn)物的合成量大大減少。3.1.7 氮源對(duì)發(fā)酵液活性的影響對(duì)在不同氮源條件下測(cè)定發(fā)酵液活性試驗(yàn)所得到的平板拍照如圖13所示，測(cè)量稻瘟菌的生長(zhǎng)直徑并繪制成圖如圖14所示。 圖 13 不同氮源條件下的抑菌圈注：a-硝酸鈉；b-蛋白胨；c-酵母膏；d-對(duì)照 圖 14 氮源對(duì)產(chǎn)生抗生素的影響觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，不同的氮源發(fā)酵得到的發(fā)酵液活性從高到低依次為：硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏，三者的差異明顯。對(duì)于芽孢桿菌XXXXXX菌來(lái)說(shuō)，相較于有機(jī)氮源來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)氮源更有利于該菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，其對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用率也更高。3.2 正交設(shè)計(jì)確定最優(yōu)化培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果如表2和圖15所示。表 2 正交組合試驗(yàn)結(jié)果No.ABCD直徑/mm抑菌率/%12345678911122233312312312312323131212331223123132617221517181633.356.713.343.326.75043.34046.7T1T2T370.0113.3110090.0106.796.7100.0123.370.063.3133.396.7X1X2X323.337.836.730.035.632.233.341.123.321.144.432.2R14.45.617.823.3 圖 15 四因素與NUST菌株產(chǎn)抗的關(guān)系由極差分析可以得出，以因素D對(duì)XXXXXX產(chǎn)抗稻瘟活性物質(zhì)的影響最為顯著，因素C、A次之，因素B最小。所以，pH為最重要因素，其次是磷酸二氫鉀、然后是可溶性淀粉、硝酸鈉為最不重要因素。各因素實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響因素作用按大小排序?yàn)?DCAB。理論優(yōu)化方案為:A2B2C2D2。即可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，pH為7。結(jié) 論本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)在不同的條件下培養(yǎng)XXXXXX菌，并測(cè)定其發(fā)酵液的抗稻瘟菌活性來(lái)評(píng)價(jià)其抑菌能力。根據(jù)單因素試驗(yàn)分析，不同的pH、轉(zhuǎn)速、溫度、接種量和氮源均能夠不同程度的影響XXXXXX菌的生長(zhǎng)。XXXXXX菌在發(fā)酵液的pH為8、接種量按照2%接種在28、210r/min的條件下生長(zhǎng)情況較佳；相反，對(duì)于不同的裝液量和發(fā)酵時(shí)間，XXXXXX菌均能夠正常生長(zhǎng)。采用合成培養(yǎng)基，氮源為硝酸鈉時(shí)，XXXXXX菌的生長(zhǎng)狀況由于在其它氮源情況下。依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，理論的優(yōu)化方案為: A2B2C2D2，即可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，pH為7。致 謝值此論文完成之際，要感謝在本科階段給予我指導(dǎo)、幫助和關(guān)心的所有人。論文是在導(dǎo)師X教授的悉心指導(dǎo)和嚴(yán)格要求下完成的，從論文的選題、方案的確定與實(shí)施、以至實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行、論文的構(gòu)思與撰寫(xiě)，無(wú)不傾注導(dǎo)師的心血與汗水。他求實(shí)創(chuàng)新的科研精神、嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的科學(xué)態(tài)度、高尚的道德情操、誨人不倦的師長(zhǎng)風(fēng)范使我在學(xué)習(xí)和生活中受益匪淺，特別是他對(duì)學(xué)生嚴(yán)格要求認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度、對(duì)科研一絲不茍實(shí)事求是的精神、對(duì)工作勤奮執(zhí)著兢兢業(yè)業(yè)的精神令我終身難忘。值此論文付梓之際，謹(jǐn)向X老師致以最崇高的敬意！在校學(xué)習(xí)及實(shí)驗(yàn)期間還得到了眾多老師的指導(dǎo)和幫助，特向X老師、X老師、X老師、X老師等表示誠(chéng)摯的謝意！特別感謝本實(shí)驗(yàn)室X博士和分子代謝中心諸位學(xué)長(zhǎng)、學(xué)姐給予我的指導(dǎo)和幫助！感謝父母給予我的學(xué)習(xí)生活上無(wú)微不至的關(guān)懷鼓勵(lì)、支持和幫助。他們對(duì)于我的關(guān)心、理解是我不斷前進(jìn)的動(dòng)力。 再次向所有指導(dǎo)、關(guān)心、幫助和支持我的老師、同學(xué)、朋友、親人致以最衷心的謝意!參考文獻(xiàn)1 張宇，張敏，葉亞軍.稻瘟病生防放線(xiàn)菌菌株A11發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性測(cè)定J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(6)：315316.2 孫國(guó)昌，杜新法，陶榮祥等.水稻稻瘟病防治研究進(jìn)展和2l世紀(jì)初研究設(shè)想J.植物保護(hù)，2000，26(1)：33353 張寧波.農(nóng)用抗生素研究進(jìn)展J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45(6)：830833.4 胡慶堂微生物農(nóng)藥生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)展J生物工程進(jìn)展，199