各種類型細胞器探針.doc

各種類型的細胞器探針線粒體線粒體是細胞的能量工廠。因其參與了細胞凋亡，這些年也成為研究的熱門。線粒體的熒光探針主要有：JC-1、Rhodamine 123等，Invitrogen還推出專門的MitoTracker 系列探針。JC-1是用得最多的。它在濃度或線粒體膜電位低時，以單體存在，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為527 nm，呈綠色熒光。當濃度升高或線粒體膜電位升高時，JC-1形成J-聚體，呈橙色熒光，此時激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為590 nm。JC-1最重要的應用是檢測活細胞內(nèi)線粒體的膜電位，以及追蹤凋亡細胞中的線粒體變化。Rhodamine 123是一種能滲透入細胞，帶陽離子的熒光探針。它的激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長為534 nm?；罴毎麛z取Rhodamine 123達到平衡的速度較快，只需5分鐘，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，即可見到線粒體被Rhodamine 123染成綠色。當細胞被反復沖洗時，Rhodamine 123通常不被細胞保留，但許多癌細胞可較長時間保留這種染料，因此，它有助于某些癌癥的診斷。MitoTracker 系列探針則是Invitrogen專為線粒體而設(shè)計的。MitoTracker是細胞通透性的，只要與細胞簡單孵育，就能被動滲透質(zhì)膜，在有活性的線粒體中積累。一旦線粒體被標記，細胞就能用甲醛固定劑固定，一些MitoTracker探針能在固定之后保留在線粒體內(nèi)。這對致病細胞格外有用。而一些探針在隨后的去污劑處理后還能保留，這樣就能用在免疫細胞化學或原位雜交中。盡管傳統(tǒng)的線粒體探針如Rhodamine 123也很容易標記線粒體，但是一旦線粒體的膜電位損失，它們就很容易被洗掉。這就限制了某些應用。MitoTracker探針又分為好幾種，且有紅色、綠色和橙色。其中還原態(tài)的MitoTracker Orange CM-H2TMRos和MitoTracker Red CM-H2Xros在進入細胞后不發(fā)出熒光，直到它們被氧化成相應的線粒體選擇性探針，并聚集在線粒體內(nèi)。紅色的MitoTracker探針都適合于多色標記實驗，因為它們的紅色熒光能與其他綠色熒光很好地區(qū)分開。盡管有些MitoTracker探針能實現(xiàn)固定細胞中的線粒體標記，但這些染料還是只推薦給活細胞。如果你想要標記固定細胞，可以選擇OxPhos的抗體+熒光二抗。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能有哪些？你還記得嗎？復習一下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞中由膜圍成的分支小管、小囊或扁平囊狀結(jié)構(gòu)連通而成的管道系統(tǒng)，可分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著有核糖體，是合成蛋白質(zhì)的主要場所；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則功能多樣，比如在肝細胞中與解毒和糖代謝有關(guān)。常用的DiOC6(3) 及相似的DiOC5(3) 都屬于短鏈羰花菁染料，它們廣泛用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究，包括神經(jīng)元、酵母中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)作用和動力學，以及不同細胞類型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和微管的形態(tài)關(guān)系。它們不僅可標記活細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也可以用于甲醛固定的細胞。DiOC6(3) 進人細胞內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，在激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)學特征很容易識別。需要注意的是，在相對低濃度時，DiOC6(3) 聚集在線粒體中，而在高濃度時，則可聚集于其他膜性細胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。長鏈的羰花菁染料DiIC16(3) 和DiIC18(3) 也可以標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。DiIC16(3) 的激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為564 nm；DiIC18(3) 的激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為565 nm，均呈黃色熒光。DiIC16(3) 和DiIC18(3) 的分子結(jié)構(gòu)與DiOC6(3) 大致相同。DiIC16(3)有兩個更長的碳鏈，使Dil不能透過膜。一旦DiI 結(jié)合到膜內(nèi)，它就保留膜中，在膜的兩層內(nèi)自由擴散。DII 已經(jīng)用來標記神經(jīng)元細胞和肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。ER-Tracker染料是Invitrogen開發(fā)的細胞通透性的活細胞染料，是ER高度選擇性的。它們與常規(guī)的ER染料DiOC6(3)不同，很少會對線粒體染色，且低濃度下的染色不會對細胞帶來毒性。ER-Tracker Blue-White DPX屬于Dapoxyl染料家族中的一員，因此有著相當大的斯托克斯位移，長發(fā)射波長，以及高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。它的熒光對環(huán)境極其敏感，當溶劑極性增加，熒光發(fā)射峰會移向更長的波長-從430 nm到640 nm，量子產(chǎn)率下降。Invitrogen推薦用標準的DAPI或UV longpass濾光片來觀察它的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色。ER-Tracker Green和ER-Tracker Red的激發(fā)/發(fā)射峰分別為504/511 nm和587/615 nm。真菌代謝物brefeldin A (BFA) 是解析多個胞內(nèi)進程的重要工具，包括參與運輸新合成蛋白的囊泡形成及驅(qū)動蛋白分布。將細胞暴露在BFA中，會引起細胞內(nèi)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白轉(zhuǎn)運的失常，最終導致高爾基體形態(tài)的喪失，而去除BFA后，這些作用會完全逆轉(zhuǎn)。除了天然的BFA外，Invitrogen還提供了綠色和橙紅色的BFA衍生物。綠色的BODIPY FL和橙紅色的BODIPY 558/568 BFA衍生物能夠在幾種細胞系中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進行選擇性染色。BODIPY 558/568 BFA可與NBD C6-ceramide共同使用，來同時了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。高爾基體高爾基復合體的功能主要是將由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運來的蛋白類物質(zhì)進行加工、濃縮、儲存和運送，最后形成分泌泡排除。高爾基復合體的熒光探針主要有NBD C6-Ceramide 和BODIPY FL C5-Ceramide 兩種。NBD C6-Ceramide呈綠色熒光，激發(fā)波長為464 nm，發(fā)射波長為532 nm，是目前應用較廣泛的選擇性染色高爾基復合體的探針。它適用于活細胞和固定細胞的染色。將熒光ceramide與BSA混合，有助于細胞標記，而無需使用有機溶劑來溶解探針。NBD C6-Ceramide 目前應用在以下方面的研究：檢測BFA對高爾基復合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的蛋白轉(zhuǎn)運的作用效果；一種遺傳性脂代謝異常的疾?。‵arbers疾?。┑难芯浚患毎麅?nèi)凝血酶受體的轉(zhuǎn)運和標記等等。另外，NBD C6-Ceramide的熒光對高爾基體的膽固醇含量特別敏感，這個現(xiàn)象是BODIPY FL C5-Ceramide所沒有的。如果含有NBD C6-Ceramide的細胞是膽固醇饑餓的，那么高爾基體中積累的熒光特別不穩(wěn)定。不過，膽固醇合成的刺激會降低這種NBD光漂白。因此，NBD C6-Ceramide在監(jiān)測活細胞中高爾基體的膽固醇含量時很有用。BODIPY FL C5-Ceramide也呈綠色熒光，激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長為511 nm。它比NBD衍生物更加明亮，且不容易衰減，因此在很多應用中都能夠替代NBD C6-Ceramide。BODIPY FL C5-Ceramide表現(xiàn)出濃度依賴的熒光特性。在高濃度，非極性的BODIPY FL熒光基團形成受激準分子，使熒光基團的發(fā)射峰從515 nm（綠色）轉(zhuǎn)移到620 nm（紅色）。反面高爾基體上的BODIPY FL C5-Ceramide積累足夠形成受激準分子，而周圍的細胞質(zhì)不會。利用紅光的濾光片就能選擇性觀察高爾基體。而且，這種二色性還能通過比例成像定量BODIPY FL C5-Ceramide的積累。溶酶體溶酶體為單層膜蛋白包圍的內(nèi)含一系列酸性水解酶的小體。溶酶體中含有多種酶，如糖苷酶、酸性磷酸酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等等，是物質(zhì)代謝的場所。弱堿性胺選擇性聚集在胞內(nèi)低pH值的小室中，可用于研究溶酶體的生物合成和發(fā)病機理。其中最常用的就是DAMP，它不發(fā)熒光，需要和抗DNP的抗體共同使用，來觀察染色模式。中性紅、吖啶橙等熒光探針也常用于酸性細胞器的染色，不過它們?nèi)狈μ禺愋?。LysoTracker探針就是Invitrogen開發(fā)的向酸性熒光探針，用于標記和追蹤活細胞中的酸性細胞器。這些探針有幾個重要的特征：對酸性細胞器的高選擇性，在納摩爾濃度下能對活細胞有效標記。而且，LysoTracker探針有幾種不同的顏色，適合多色標記。LysoTracker探針是細胞膜通透性的，一般聚集在球形的細胞器中。研究人員發(fā)現(xiàn)探針在極低濃度（50 nM）下選擇性最佳。此外，較大的酸性細胞器在LysoTracker Red DND-99染色后，經(jīng)過甲醛固定仍保留其染色模式。對于那些想研究溶酶體生物發(fā)生動力學的研究人員來說，LysoSensor探針可謂量身定做。LysoSensor染料是向酸性的探針，由于質(zhì)子化作用聚集在酸性細胞器中。質(zhì)子化也緩解了染料的熒光淬滅，使熒光強度增加。因此，LysoSensor在酸化的環(huán)境中表現(xiàn)出pH依賴的熒光強度增加，而LysoTracker探針的熒光則沒有明顯變化。Invitrogen提供了5種LysoSensor試劑，pKa不同，顏色各異。LysoSensor Blue DND-167和LysoSensor Green DND-189的pKa值很低，處于酸性環(huán)境中才會發(fā)出熒光，而LysoSensor Green DND-153在中性pH下就發(fā)出很強的熒光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160很特別，具有雙激發(fā)和雙發(fā)射峰，是pH依賴的。在酸性細胞器中，它主要發(fā)黃色熒光，而在弱酸性細胞器中，熒光則為藍色。LysoSensor Yellow/Blue DND-160曾與fluo-3 AM共用，來同時測量兔胃腺中H+ 和Ca2+，以確定類膽堿和cAMP依賴通路激活后胃酸分泌的動力學。除了上面這些傳統(tǒng)的熒光探針，Invitrogen的Organelle Lights?熒光蛋白也是一個不