轉(zhuǎn)基因小鼠的方法概述.doc

轉(zhuǎn)基因小鼠的應用及其制備方法學 院：動物科技學院專業(yè)班級： 學生姓名： 學 號： 指導老師： 時 間：2015年12月17日老師，這篇文章是在圖書館分子生物技術(shù)重組DNA的原理與應用書上整理下來的，沒有參考文獻，但是，這一萬多字都是自己親手打下來的，圖也是自己用軟件畫的，其中的原理也都弄懂，愿老師見諒。轉(zhuǎn)基因小鼠的應用及其制備方法 （西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100）摘 要 隨著后基因組時代的到來，轉(zhuǎn)基因動物已成為新興的最有效的實驗模型。從上世紀80年代以來，上百個不同的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入各種品系的小鼠中。這有助于理解基因調(diào)控，腫瘤發(fā)展，免疫特異性，發(fā)育分子遺傳學以及人們感興趣的其他生物學過程。轉(zhuǎn)基因小鼠也已在探索利用家畜進行人類治療藥物工業(yè)化生產(chǎn)的可能性，以及建立各種人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因生物醫(yī)學模型中起到重要作用?，F(xiàn)就制備轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗方法及應用前景作簡單介紹。關(guān)鍵詞 醫(yī)學模型；試驗方法；應用前景Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling,Shaanxi,712100,China )Abstact: Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice.Key words: biomedical model; experimental methods; application prospect1990年人類基因組計劃正式啟動，經(jīng)過13年的努力，人類基因組序列圖繪制成功及人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。人們迎來一個嶄新的時代后基因組時代，即在基因組靜態(tài)的堿基序列逐步清楚之后而最基因組進行動態(tài)的生物學功能研究。轉(zhuǎn)基因動物在后基因組時代已成為生命科學研究中新作者簡介： 本科，動物科學專業(yè)。Email:；Tel： *通訊作者： E-mail： 興的最有效的動物實驗模型。小鼠是最早建立的轉(zhuǎn)基因動物模型，利用轉(zhuǎn)基因小鼠進行生物學或生物醫(yī)學研究是當前生命科學發(fā)展的主要內(nèi)容之一。轉(zhuǎn)基因小鼠是一個思維體系，所研究的問題都是在活體中進行的，類似于人體內(nèi)的各種背景因素仍然存在，通過這套體系所得出的研究結(jié)論具有很高的真實性。因此，其成為生命科學領(lǐng)域中的研究利器。一、方法學1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法1974年，Jaenisch等試圖用病毒感染早期胚胎的方式將SV40 DNA腫瘤病毒基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，但是這樣的基因并沒有參與整個發(fā)育過程，傳代的機會也很小。1976年，Jaenisch又通過反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的胚胎。在各種基因轉(zhuǎn)移法中，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法（圖1-1）能夠有效地將基因整合在受體細胞基因組上。但缺點是只能導入小片段基因（8kb左右）。由于受到大小的限制，轉(zhuǎn)移的基因可能缺少表達調(diào)控序列。這話總方法還有一個缺陷，雖然這些載體設計為復制缺陷型，但由于產(chǎn)生大量載體DNA所必須的逆轉(zhuǎn)錄病毒品系（輔助病毒，helper virus）的基因組，可能和轉(zhuǎn)移的而基因一起整合到同一個細胞核上。盡管有特殊的預防措施，轉(zhuǎn)基因生物仍有可能產(chǎn)生輔助病毒。但是，在應用轉(zhuǎn)基因生物合成商業(yè)產(chǎn)品或直接作為食品過程中，必須絕對保證沒有逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。轉(zhuǎn)基因已有其他可行的方法，因此很少用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法來產(chǎn)生具有商業(yè)用途的轉(zhuǎn)基因動物。2. DNA顯微注射法由于逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法存在的缺點，近來DNA顯微注射法是一種建立轉(zhuǎn)基因小鼠的更好的方法。1980年底，Gordon等4首次通過顯微注射將純化的外源基因轉(zhuǎn)入到小鼠的受精卵原核，為建立轉(zhuǎn)基因小鼠奠定了基礎(chǔ)。1982年，美國學者Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫?，培育?1只子代小鼠中有7只含融合基因，其中6只加速生長，即“超級小鼠”誕生了。這種方法的過程由以下步驟組成圖2-1對供體母鼠進行超數(shù)排卵處理，增加用于顯微注射的受精卵數(shù)。其方法是先給母鼠注射懷孕母鼠的血清，大約48 h后，在注射人絨毛膜促性腺激素。經(jīng)過處理的小數(shù)能產(chǎn)下35枚左右的卵，而正常情況下只有510枚。與雄鼠交配后殺死這一超數(shù)排卵的母鼠，沖洗并收集輸卵管中的受精卵。 通常立即進行受精卵顯微注射。注射的外源基因一般是線性結(jié)構(gòu)且不含有原核生物載體的DNA序列。哺乳動物中，精子進入卵細胞后，精子細胞核（雄原核，male pronucleus）與卵細胞核獨立存在。在卵細胞核經(jīng)過減數(shù)分裂成為雌原核后（female pronucleus）,才會發(fā)生核融合（karyogamy）。雄原核一般比雌原核大，使用街鋪顯微鏡就能確定位置。在顯微注射中受精卵可以進行顯微操作、定位及固定。將接種后的2040個受精卵利用顯微外科的方法植入受體母鼠體內(nèi)，這種母鼠與切除輸精管的雄鼠交配后進入假孕狀態(tài)。對于小鼠來說，交配是已知能使子宮為植入受精卵做好準備的唯一方法。移植3星期后，養(yǎng)母便繁殖出從接種受精卵發(fā)育而來的幼鼠。為了鑒定轉(zhuǎn)基因動物，從小鼠的尾巴提取的DNA進行Southern雜交或者PCR，可以確定轉(zhuǎn)基因的存在。轉(zhuǎn)基因小鼠之間交配以確定轉(zhuǎn)基因是否存在首建鼠（founder）的生殖細胞中，隨后，進一步雜交培育出純合轉(zhuǎn)基因品系。這種方法雖然簡單，但需要許多實驗步驟。即使是一個操作熟練的工作人員，最多只能使5%的移植受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物圖2-2。在這個過程中，沒有一個步驟的效率可達100%，因此必須使用大量的受精卵進行顯微注射。以小鼠為例，注射后大約有66%的受精卵能夠存活，25%的移植卵能夠發(fā)育成小鼠，而其中約有25%的小鼠是轉(zhuǎn)基因個體。因此從1000個受精卵中，只能產(chǎn)生3050個轉(zhuǎn)基因小鼠。另外，這種方式注射的DNA隨機整合到基因組中，并且常在同一位點以多拷貝的形式存在，所以并不是所有的轉(zhuǎn)基因小鼠都具有預期的特性。某些個體中，由于整合位點的緣故可能使轉(zhuǎn)基因不表達；另一些個體中，拷貝數(shù)過多可能導致過量表達，因而擾亂了動物正常的生理功能。盡管這種方法效率那很低，但DNA顯微注射法還是建立有功能的轉(zhuǎn)基因小鼠品系的常規(guī)方法。圖1-1 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體建立 圖2-1 利用顯微注射的方法構(gòu)轉(zhuǎn)基因小鼠品系 轉(zhuǎn)基因小鼠品系3. 工程化胚胎干細胞從發(fā)育的小鼠胚胎中獲得的胚胎期（blastocyst stage）細胞,能夠在細胞培養(yǎng)基中繁殖，并在導入另一個胚泡時，保持分化成其他各種類型細胞（包括生殖系細胞）的能力，這類細胞稱為全能性胚胎干細胞（ES）。培養(yǎng)的ES細胞易于進行遺傳工程改造而不改變其全能性。利用這個系統(tǒng)，有功能的轉(zhuǎn)基因可以整合在ES細胞的基因組中某個非必須基因的特定位點。然后，選擇和培養(yǎng)這些基因工程細胞，并用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物圖3-1。采用這種方法，就可以避免DNA顯微注射法和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法中隨機整合的缺點。利用染色體特意位置整合的DNA載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的ES細胞時一些細胞中的DNA整合發(fā)生在非靶位點（錯誤位點），另一些細胞中整合發(fā)生在靶位點（正確位點），而大多數(shù)ES細胞中根本沒有發(fā)生整合。采用一種正負選擇方法，來富集正確整合的ES細胞。其策略是采用正選擇獲得正確整合的細胞，而負選擇剔除錯誤整合的細胞。靶位點必須位于基因組的非必需基因中，這樣才能在外院DNA整合后，對細胞發(fā)育和功能沒有影響。另外，轉(zhuǎn)基因還必須整合在基因組中正常轉(zhuǎn)錄的部位。研究人員一直在尋找這種位點。正負選擇方法中應用的DNA載體通常包括：與靶位點的兩個位置同源的兩個DNA序列區(qū)（HB1和HB2）；轉(zhuǎn)入的基因（transgene）賦予受體新的功能；化合物G-418的抗性基因（Neor）；來自I型、型單純皰疹病毒（HSV-tk1和HSV-tk2）編碼胸苷激酶（thymidine kinase）的兩個不同基因（tk1和tk2）圖3-2（a）.這一序列的組合是這一方法中的關(guān)鍵元素。在于靶位點同源的兩個DNA序列間是轉(zhuǎn)基因的G-418抗性基因（Neor gene），兩個同源區(qū)外是HSV-tk1和HSV-tk2基因。如果整合發(fā)生在錯誤位點（不在HB1和HB2上），HSV-tk基因很可能與其他序列整合圖3-2(a)。相反，如果整合是通過靶位點雙交換的基因重組，HSV-tk基因?qū)⒈惶蕹?，只有轉(zhuǎn)基因和Neor基因整合在基因組上圖3-2(b)。轉(zhuǎn)染的細胞在G-418存在情況下生長時，缺少Neor基因的細胞將被殺死。因此，只有整合了目的DNA的細胞才能存活，這是正選擇。同時加入更昔洛韋9-(1,3,-二羥基-2-丙氧甲基)-鳥嘌呤和G-418時，由于胸苷激酶能將更昔洛韋轉(zhuǎn)變?yōu)闅⑺兰毎亩舅?，所以表達胸苷激酶的細胞就會死亡，這是負選擇。雙重選擇下存活的就是正確整合的細胞。雖然并不是很簡單，但這種正負選擇方法能從ES細胞群體中富集在染色體特定位點整合轉(zhuǎn)基因的細胞。更為直接判斷ES細胞是否在染色體靶位點攜帶轉(zhuǎn)基因的方法是采用PCR鑒定。這種情況下，DNA載體含有兩段與靶位點同源的DNA區(qū)段，分別位于轉(zhuǎn)基因和一段克隆的細菌基因（或人工合成的特有基因，在小鼠基因組中不存在）的兩側(cè)圖3-3。轉(zhuǎn)染ES細胞后，收集細胞，并采用PCR篩選。PCR的一條引物（P1）與克隆載體的細菌DNA序列互補，另一條（P2）與染色體上同源DNA區(qū)段相鄰的部分序列互補。如果整合發(fā)生在隨即位點，就不會產(chǎn)生預期的DNA擴增產(chǎn)物圖3-3（a）。如果發(fā)生位點特異性的整合，PCR會擴增出預期大小的DNA片段圖3-3（b）。采用這種方法，可以從細胞庫中鑒定含有在靶位點整合轉(zhuǎn)基因的ES細胞。從細胞庫中克隆培養(yǎng)，建立位點特異性整合的細胞株。培養(yǎng)整合性轉(zhuǎn)基因ES細胞并植入胚泡期的胚胎中，再將這些胚胎移植入假孕的受體母鼠。生殖細胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的小鼠通過雜交得到轉(zhuǎn)基因小鼠品系。如果有必要的話，繼續(xù)雜交，產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因通過基因重組插入ES細胞的某個特異的染色體位點，不僅帶來新的功能，而且可以將DNA序列（通常為選擇性的標記基因）轉(zhuǎn)入基因編碼區(qū)，重點干擾某個特定的小鼠基因圖3-4.定點基因干擾（基因剔除,gene knockout）的目的之一是通過使一個特異基因失活來觀察對發(fā)育和生理方面的影響。另一個目的是希望帶有時或基因的轉(zhuǎn)基因品系，研究人類疾病的分子病理學的動物模型。 圖3-1 利用工程化胚胎干細胞法 圖3-2 正負選擇法 建立轉(zhuǎn)基因小鼠品系圖3-3 PCR鑒定轉(zhuǎn)染細胞中非特異性整合和同源重組圖3-4 定向同源重組阻斷基因4. Cre-loxP重組系統(tǒng)用于遺傳改良轉(zhuǎn)基因小鼠的每一個細胞通常都帶有轉(zhuǎn)基因或者通過基因修飾（基因剔除）。盡管如此，建立一種系統(tǒng)，能選擇性控制某個基因在體內(nèi)某些組織或細胞中特異性表達，將會很有用處。為此，從P1噬菌體的遺傳元件中發(fā)展了Cre-loxP重組系統(tǒng)。P1噬菌體和噬菌體在形態(tài)上相似。他們都有一個頭，一個尾，還有尾部纖維。P1的基因組長度大約100kb，侵入大腸桿菌后，線性的基因組變成環(huán)裝，并作為復制的模板。隨著不同系列基因的活化，環(huán)狀DNA既能像質(zhì)粒一樣行使功能，又能作為裂解周期中病毒基因組復制的模板。極少數(shù)情況下，環(huán)狀的P1基因組會整合到大腸桿菌染色體中。P1基因組的環(huán)化和整合都需要crecircularization recombination protein(Cre重組酶)基因產(chǎn)物的介導，它能特異性剪切和重組在loxPlocus of crossing over (x) in P1,重組位點 位點的DNA。一個loxP位點包括兩段13bp的反向重復序列，中間由一段8bp的間隔序列隔開圖4-1。簡單地說，Cre-loxP重組會將兩個遠離的loxP位點相互靠近，其中每一個loxP位點結(jié)合兩個Cre重組酶分子，并通過Cre重組酶在重復序列之間的間隔序列處剪切、交換和連接DNA鏈，形成重組DNA分子。重組的結(jié)果與loxP位點的重復序列的方向有關(guān)。如果重復序列是相反的，通過交換插入了兩個loxP位點之間的DNA。如果重復序列是相同的，則刪除或切離之間的序列。P1噬菌體中天然存在的重復序列方向都是相反的。當兩個loxP位點相距很遠時，Cre-loxP重組系統(tǒng)也能發(fā)揮作用。例如，P1噬菌體基因組環(huán)化所需的兩個loxP位點相距大約100kb（千堿基對），Cre-loxP系統(tǒng)的特異性是很高的，因為Cre重組酶只與loxP位點發(fā)生作用。基于上述特性，開發(fā)Cre-loxP重組系統(tǒng)用于小鼠細胞的細胞特異性基因修飾。整個過程的第一步是分離cre基因，并置于一個組織特異性啟動子的調(diào)控之下。建立攜帶有cre基因構(gòu)件的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，并檢測確定具有組織特異性的Cre活性。下一步，克隆DNA序列的兩段插入兩個方向相同的loxP位點。該DNA片段稱為DNA floxed(flanked by loxP site)。含有選擇標記基因且兩端連上loxP位點的構(gòu)件通過同源重組整合到胚胎干細胞染色體的一個位點上。細胞經(jīng)過篩選、培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)基因品系。然后，帶有組織特異性cre基因的轉(zhuǎn)基因小鼠與帶有l(wèi)oxP位點的構(gòu)件的轉(zhuǎn)基因小鼠交配。cre基因在雙轉(zhuǎn)基因小鼠中表達后，就剔除了兩個Cre-loxP位點之間的DNA。圖4-1。Cre-loxP技術(shù)已廣泛應用于研究組織特異性基因失活所產(chǎn)生的生物學效應，以期建立人類疾病研究的模型利用Cre-loxP重組系統(tǒng)也可以實現(xiàn)較大的染色體畸變（如缺失）。圖4-1 特定細胞類型中使基因失活的Cre-loxP重組系統(tǒng)5. 利用大容量載體轉(zhuǎn)基因一般而言，轉(zhuǎn)基因是互補DNA（complementary DNA,cDNA）、小基因（不大于20kb）或者部分基因。但通常cDNA在哺乳動物細胞中表達效果很差。同樣,基因組DNA用來轉(zhuǎn)基因時，上游或下游的基因特異性的重要調(diào)控序列很少保留在插入序列中。而且，全基因或復合的多基因（不大于100kb）對于傳統(tǒng)的載體來說太大了。由于上述原因，利用大容量載體（如細菌，P1噬菌體，哺乳動物和酵母人工染色體，對應縮寫為RAC,PAC,MAC,YAC）來進行轉(zhuǎn)基因，這種載體可以攜帶1001000kb不等的基因組DNA。利用攜帶一系列相關(guān)基因或單個大基因的YAC顯微注射受精卵的原核或者轉(zhuǎn)染胚胎肝細胞，可以得到轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠可以用來研究發(fā)育的過程，并作為人類疾病研究的模型，或者用于生產(chǎn)人類治療藥劑。譬如，人類-球蛋白基因簇大概有25kb，包含5個不同的功能球蛋白基因。帶有人類-球蛋白基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠，與人類的組織特異性和時序性表達相對應，在一定時間內(nèi)組織特異性表達這些基因。這個方法是通過含有啟動子區(qū)域和其他重要調(diào)控元件的兩側(cè)DNA序列得以實現(xiàn)的。另一個YAC轉(zhuǎn)基因的成功應用是產(chǎn)生單純合成人類抗體的小鼠。理論上，單克隆抗體可以成為減弱癌細胞增殖的有效藥劑，也可以作為一種治療其他人類疾病的手段。但問題在于無法輕而易舉地獲得認得單克隆抗體。而且，遺憾的是，嚙齒動物的單克隆抗體對人具有免疫原性。為此，設計繁瑣的重組DNA方法來產(chǎn)生嚙齒動物“人源化”的單克隆抗體。這種抗體分子中，只有5%10%的成分是鼠源的。在很多情況下，這種費力的方法生產(chǎn)出來的抗體與特定抗原的結(jié)合能力很低，并且可能引起人體免疫反應。而且，每一種作為治療藥劑的單克隆抗體都必須進行人源化。因此，人們更加歡迎一種更具可行性的，從雜交瘤獲得廣譜的完全人源化抗體的技術(shù)系統(tǒng)。天然抗體的形成過程是生物學上的一個奇跡?？贵w是一個由兩對不同鏈組成的四聚體蛋白。一條鏈叫做重（H）鏈，另一條叫做輕（L）鏈?！爸亍焙汀拜p”是根據(jù)這兩個抗體亞基的分子量的大小來區(qū)分的。一條特定的重鏈的遺傳信息由B細胞的基因組重排獲得，重排的部分包括可變區(qū)（VH）、多變區(qū)（DH）、連接區(qū)（JH）和保守區(qū)（CH）的DNA片段（或結(jié)構(gòu)域，domain）。抗體的輕鏈由兩種不同類型（和），也是通過各自的DNA重排得到的，其中包括可變區(qū)（V和V）、連接區(qū)（J和J）和保守區(qū)（C和C）。一個B細胞只合成一種抗體分子，由一條新的重鏈和重排的鏈或鏈組成特有的組合。產(chǎn)生大量不同抗體的基因組合中，重鏈部分包括95個VH、30個DH和6個JH片段，以及5個主要的保護區(qū)（C、C、C、C和C）。基因位點由76個V、5個J和1個C片段圖5-1。H和基因座位大小約為11.5Mb。為了建立合成大量不同的人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，必須先失活小鼠自身的重鏈和輕鏈基因，再將攜帶大量人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的YAC插入小樹的染色體DNA。為此，一組研究人員分別剔除了小鼠的JH和CDNA序列，然后培育這些基因剔除小鼠，挑選不能合成任何鼠抗體的后代。下一代，構(gòu)建兩個YAC都帶有一個標記基因，通過酵母原生質(zhì)球與胚胎肝細胞的融合進行轉(zhuǎn)染后，篩選攜帶YAC的胚胎肝細胞。PCR驗證插入的序列是否完整。分別將攜帶重鏈基因和基因的細胞注入胚泡中，通過PCR鑒定出轉(zhuǎn)基因成功的首建鼠。隨后這些轉(zhuǎn)基因小鼠與剔除了小鼠重鏈和鏈基因的小鼠交配，產(chǎn)生的后代繼續(xù)相互交配，篩選雙剔除和雙插入的小鼠，即剔除了小鼠的重鏈和鏈基因，而攜帶了人類重鏈和鏈基因的小鼠。利用各種抗原免疫這種產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠后，制備雜交瘤細胞，產(chǎn)生并鑒定單克隆抗體。雖說產(chǎn)生的抗體只針對抗原，但是由于每一個插入的重鏈和鏈基因可變區(qū)數(shù)目有限，小鼠不能產(chǎn)生全系列的所有抗體，這個缺點可以通過構(gòu)建能夠攜帶更多的人重鏈和鏈基因可變區(qū)的YAC來克服。通過組合四個帶有人重鏈和鏈基因的YAC載體片段，得到一個攜帶66個VH片段、30個DH片段、6個JH片段以及C、C和C的1000kb大小的YAC。類似的，通過組合3個帶有不同的V片段的YAC，得到一個帶有32個V片段、5個J片段和C片段的YAC.這些構(gòu)件轉(zhuǎn)入胚胎干細胞，建立只產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。這些轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生針對每一種抗原的全系列人類抗體。為了驗證這一結(jié)果，利用三種不同的抗原免疫“產(chǎn)生人類抗體”的轉(zhuǎn)基因小鼠，針對每一種免疫抗原，通過雜交瘤分泌的人單克隆抗體都能與其高親和性結(jié)合。在動物實驗中，轉(zhuǎn)基因小鼠中得到的人類單克隆抗體用來結(jié)合表皮生長因子，可以抑制過量表達該蛋白的癌細胞的增殖。人類臨床試驗證明，小鼠中得到的人類單克隆抗體不具有免疫原性。因此轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)非常有希望開發(fā)成為生產(chǎn)治療性人單克隆克隆抗體的常規(guī)系統(tǒng)。產(chǎn)生人類抗體的商品化小鼠已注冊為XenoMouse。圖5-1 人免疫球蛋白鏈和重鏈基因的示意圖二、轉(zhuǎn)基因小鼠的應用轉(zhuǎn)基因小鼠可作為一種研究人類疾病生物基礎(chǔ)及各種治療方案的生物模型，也可用于檢測潛在的治療藥物的模型系統(tǒng)。這種實驗室小鼠稱為“智能檢測試管”，完整的動物模型可以模擬人類疾病的發(fā)生和發(fā)展的進程。但即便小鼠是哺乳動物，與人類還是有很大差別，因此醫(yī)學上轉(zhuǎn)基因模型提供的信息并不總是相關(guān)的。因此，建立了諸如阿爾茲海默癥、肌萎縮性（脊髓）側(cè)索硬化、亨廷頓舞蹈癥、關(guān)節(jié)炎、肌營養(yǎng)不良、腫瘤發(fā)生、高血壓、神經(jīng)退行性病變、內(nèi)分泌機能障礙、冠心病等其他許多人類遺傳疾病的小鼠模型。1.阿爾茲海默癥的轉(zhuǎn)基因模型阿爾茲海默癥（Alzheimer disease）是一種退行性大腦功能紊亂。它的主要特征是逐漸喪失抽象思維能力和記憶力，并伴有性格改變、語言障礙和行動緩慢。雖然6065以及80歲以上的人群中，存在1%和30%患病的可能，但該病的臨床診斷效果很不明顯。阿爾茲海默癥患者大腦的神經(jīng)元中的神經(jīng)纖維纏結(jié)積聚；神經(jīng)節(jié)末梢形成的高密度細胞外聚物，稱為老年斑新皮質(zhì)和海馬體中的腦細胞（神經(jīng)元）死亡。老年斑的核心由一個致密的纖維狀通常稱為淀粉樣小體的結(jié)構(gòu)組成。起先認為，淀粉樣小體（amyloidbody）是由碳水化合物組成但是越來越多的分析證明，它是一個蛋白聚小體。盡管發(fā)現(xiàn)了這個誤稱，但是“淀粉樣小體”一詞還是沿用至今。阿爾茲海默癥淀粉樣小體中主要的蛋白石一個4kDa的蛋白，稱為A蛋白（amyloid、-protein、-amyloid protein或者/A4）。A蛋白長度從3942個氨基酸不等，A40和A42是兩種主要的形式。所有的A蛋白都是-淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)蛋白水解酶剪切而成。APP蛋白的錯誤剪切產(chǎn)生了A40和A42，如果這些蛋白不及時清除，就會積聚。一些阿爾茲海默癥高發(fā)的家族在APP基因上突變，顯示該基因的功能可能失常。遺憾的是，以人體為對象研究阿爾茲海默癥的發(fā)病機理和過程幾乎是不可能的。因此，模擬阿爾茲海默癥的動物模型，將是極其重要的研究工具。已經(jīng)獲得許多轉(zhuǎn)基因小鼠，攜帶神經(jīng)元特異性啟動子調(diào)控下的正常APP全基因或部分基因。在大多數(shù)的情況下，觀察不到淀粉樣斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)細胞死亡或者行為障礙。但在一些情況下，神經(jīng)退行性病變和其他的一些特征還是與阿爾茲海默癥相似。例如，APP末端100個氨基酸的編碼序列和A蛋白序列組成的轉(zhuǎn)基因，能夠產(chǎn)生類似于阿爾茲海默癥的組織學特征。攜帶APP突變基因的轉(zhuǎn)基因模型是更加令人信服的阿爾茲海默癥動物模型。該基因在一些早期（50歲）高發(fā)阿爾茲海默癥的家族中存在。其中一個家族的APP基因的717位（APP-717），苯丙氨酸代替了纈氨酸。在另外一些阿爾茲海默癥家族中，APP基因的670位和671位（APP-670/671）分別由天冬酰胺酸和亮氨酸代替了纈氨酸和甲硫氨酸。由APP cDNA構(gòu)件帶有APP-717突變的基因。在APP cDNA外顯子67之間、78之間以及89之間插入了修飾過的內(nèi)含子，因為實驗表明這種基因的轉(zhuǎn)錄效率高于未插入的基因。利用大腦組織中表達的血小板源生長因子-的轉(zhuǎn)基因調(diào)控“APP cDNA-內(nèi)含子”構(gòu)件。完整的構(gòu)件稱為PDAPP小基因。轉(zhuǎn)基因后，大于6個月的轉(zhuǎn)基因小鼠（帶有40個拷貝的PDAPP小基因）會出現(xiàn)淀粉樣斑、神經(jīng)元細胞死亡和記憶力衰退的癥狀。PP-670/671突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，由大腦特異性啟動子調(diào)控，產(chǎn)生包括表達A42在內(nèi)的阿爾茲海默癥類似癥狀。但有趣的是，PDAPP小基因小鼠和APP-670/671轉(zhuǎn)基因小鼠均未表現(xiàn)出神經(jīng)元纖維纏結(jié)。這些結(jié)構(gòu)或許是過量表達A42產(chǎn)生的二級反應。另外三個基因，突變載脂蛋白E基因ApoE4、早老素基因PS1（presenilin 1 gene）和PS2（presenilin 2 gene）在阿爾茲海默癥中也有一定作用。如果ApoE（在脂類運輸中起作用的載脂蛋白）座位出現(xiàn)ApoE4等位基因，則個體在60歲發(fā)生阿爾茲海默癥的可能性大大增加。在早發(fā)性阿爾茲海默癥的家族中發(fā)現(xiàn)早老素基因的突變子。許多研究均表明，PS基因突變使A42集聚增多。例如，帶有全長的人類APP突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和帶有PS1突變基因小鼠雜交得到的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，在與阿爾茲海默癥患者腦部相同的位置生成過量的A42。美國約有400萬阿爾茲海默癥的患者，每年耗費約1000億美元。建立動物模型將有助于對該病的有關(guān)分子機理的關(guān)鍵問題進行研究。圖1-1 模擬阿茲海默癥的轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA構(gòu)件2.轉(zhuǎn)基因小鼠作為檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因小鼠用來監(jiān)測特定的蛋白能否分泌進入乳汁。例如，研究真實的囊腫性纖維化穿膜調(diào)節(jié)（cystic fibrosisi transmenbrance regulator,CFTR）蛋白的功能，或驗證囊腫性纖維化（cystic fibrosis,CF）的治療效果，就需要大量的蛋白。每2500個歐洲人就有一個這種遺傳病的患者。CFTR基因突變的初步效應是改變該蛋白作為氯離子通道的功能。如果中斷氯離子正常出入細胞，粘液就在一些器官（特別是肺和胰腺）的管腔中積累。這些粘液變成細菌感染的場所，抗生素很難對其進行控制，細菌死后，釋放出DNA使粘液變得更粘稠，堵塞了這些器官的管道，從而影響器官的正常功能，因而惡化了CF效應。目前，CF患者的預期壽命一般為2530歲。可能由于CFTR在轉(zhuǎn)染細胞的細胞膜上積累造成的生物學效應，CFTR在常規(guī)的體外細胞表達系統(tǒng)中的產(chǎn)量很低。如果不斷去掉宿主細胞的質(zhì)膜就可解決這個問題。利用這一系統(tǒng)，異源穿膜蛋白能與質(zhì)膜釋放的碎片結(jié)合，而且該重組蛋白的濃縮、純化過程都將更為直接。事實上，哺乳期間，乳腺細胞即是利用該方法來合成脂肪球，乳腺細胞內(nèi)的脂肪被質(zhì)膜包裹后一起以小球的形式分泌到乳汁中。為了檢測這個系統(tǒng)的可行性，將全長的CFTR cDNA序列克隆到缺陷的山羊-酪蛋白基因中間，該基因在外顯子2的末端到外顯子7起始端之間有一段缺失。這一構(gòu)件保留了-酪蛋白基因的啟動子和終止序列。將CFTR cDNA克隆島結(jié)構(gòu)基因，是為了提供內(nèi)含子序列，提高轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄效率。哺乳期間，激活并表達乳腺細胞中的-酪蛋白基因，成為主要的乳蛋白。已經(jīng)建立帶有CFTR序列的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，該基因置于-酪蛋白基因調(diào)控序列的調(diào)控之下。正如預期的那樣，轉(zhuǎn)基因鼠的乳汁中含有連接在脂肪球膜上的CFTR蛋白。這對母鼠和哺乳的幼鼠并沒有產(chǎn)生什么負面影響，經(jīng)過糖基化的CFTR蛋白，很容易從乳汁中富含脂肪的部分提取出來。該蛋白是否具有功能有待考證。這個實驗的成功表明了在乳汁中生產(chǎn)膜連接的蛋白石可行的。哺乳期轉(zhuǎn)基因小鼠已用來合成許多其他可能對人類有治療作用的蛋白。為了獲得大量的CFTR、其他穿膜蛋白或者多種人類治療用蛋白質(zhì)，需要將轉(zhuǎn)基因整合到牛、綿陽、山羊等大牲畜的基因組中。轉(zhuǎn)基因小鼠還可用來驗證其他多種設想。例如，奶牛中25%的乳腺炎（mastitis）是由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起的。這種感染具有傳播性，極易在整個畜群中傳播。奶牛感染后產(chǎn)奶量極易下降。目前，雖然美國每年花費17億美元用于防治金黃色葡萄球菌引起的乳房炎，但該病的爆發(fā)仍然得不到有效控制。如果奶牛能在牛奶中分泌葡萄球菌溶血素（staphylolytic agent）,就有可能預防感染。為此，選擇溶血性葡萄球菌（Staphylococcus simulans）產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，溶葡萄球菌素（lysostaphin）就能達到這一目的。溶葡萄球菌素是一種能夠特異性攻擊金黃色葡萄球菌細胞壁的水解酶。但是，用天然基因轉(zhuǎn)染的真核生物細胞中只能產(chǎn)生無活性形式的溶葡萄球菌素。這是由于其中兩個天冬酰胺糖基化的結(jié)果。這個問題可以通過體外誘變，將兩個天冬酰胺的密碼子替換成谷氨酰胺的密碼子來解決。經(jīng)過突變的溶葡萄球菌素在真核生物細胞中合成后不會被糖基化，并完全具有抗金黃色葡萄球菌的活性。將突變的葡萄球菌素基因置于綿羊-乳球蛋白啟動子的調(diào)控下，建立轉(zhuǎn)基因小鼠。在乳汁中大量分泌溶葡萄球菌素的小鼠，大劑量接種金黃色葡萄球菌后不被感染與對照組相比，只產(chǎn)生少量溶葡萄球菌素的轉(zhuǎn)基因品系能夠抵御致病劑量的金黃色葡萄球菌的感染。未處理的轉(zhuǎn)基因小鼠非常健康，與對照小組相比，生理和組織學并無差異。因此，理論上，這個系統(tǒng)可望成為控制金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎的有效途徑。但是，這個方法可能產(chǎn)生抗溶葡萄球菌素的金黃色葡萄球菌，所以可以通過攜帶其他抗葡萄球菌蛋白的雙轉(zhuǎn)或三轉(zhuǎn)基因動物形式改進這種方法。圖2-1 山羊-酪蛋白基因-CFTR cDNA的表達構(gòu)建3.條件控制基因表達設計多種方法根據(jù)人的意愿在特定類型的細胞中打開或關(guān)閉轉(zhuǎn)基因的表達。其中，四環(huán)素誘導系統(tǒng)是一種廣泛應用的系統(tǒng)。四環(huán)素誘導系統(tǒng)是基于同一細胞中的兩種轉(zhuǎn)錄單元，一個單元的產(chǎn)物控制另一個單元的基因表達。在一種四環(huán)素誘導系統(tǒng)中，加入一種四環(huán)素的無毒類似物強力霉素（doxycycline,Dox）,能夠關(guān)閉轉(zhuǎn)基因的表達。沒有強力霉素的情況下，轉(zhuǎn)基因能在特定類型的細胞內(nèi)持續(xù)表達。這種“tet-off”系統(tǒng)依靠一種由四環(huán)素阻抑物和一段能激活轉(zhuǎn)錄的氨基酸序列組成的嵌合（雜合）蛋白。這個雜合蛋白叫做四環(huán)素控制轉(zhuǎn)錄激活物（tetcyline-con-trolled transactivator,tetracycline transactivator,tTA）。編碼tTA的基因（tTA）處在一個細胞特異性啟動子上游的四環(huán)素操縱基因（tetO）序列組成。tTA蛋白結(jié)合到tetO區(qū)域，驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。tTA蛋白與tetO-啟動子區(qū)域的結(jié)合，是轉(zhuǎn)錄起始所必需的，但tetO本身不能啟動轉(zhuǎn)錄。當強力霉素存在時，它與tTA蛋白結(jié)合形成的Dox-tTA復合物不能與tetO-啟動子序列結(jié)合，轉(zhuǎn)基因便不能轉(zhuǎn)錄。因此，強力霉素的有無，就充當了控制tTA基因的細胞特異性啟動子的開關(guān)。圖3-1(a)一個作用相反的系統(tǒng)叫做“tet-on”。這個系統(tǒng)在Dox存在的情況下，才能進行轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。在這個系統(tǒng)中，編碼四環(huán)素阻抑物的核苷酸序列突變，使阻抑物蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物不能與tetO-啟動子序列結(jié)合。這個四環(huán)素阻抑物/轉(zhuǎn)錄激活物蛋白稱為反向四環(huán)素控制轉(zhuǎn)錄激活物（reverse tetracycline-controlled transactivator system,rt-TA），強力霉素與rtTA的結(jié)合能夠改變其構(gòu)象，使復合物又能與tetO-啟動子序列結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。圖3-1（b）這個四環(huán)素-調(diào)控系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄單元，可以插入同一個質(zhì)粒中，這樣就減少了建立轉(zhuǎn)基因小鼠所需的步驟。強力霉素可以直接加入小鼠的飲用水中。tet-off和tet-on系統(tǒng)有許多用途。比如，可以詳細研究一個異常蛋白的產(chǎn)生和一個正常蛋白的過量表達所帶來的生物學效應，模擬細胞特異性的疾病發(fā)生條件，和檢測一種能影響特定細胞類型的疾病的基因治療效果。應用四環(huán)素-調(diào)控系統(tǒng)的一