7.微生物遺傳育種.ppt

第七章微生物的遺傳變異與育種 理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求 遺傳性狀穩(wěn)定 生長速度快 不易被噬菌體等異種微生物污染 目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率 目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到細(xì)胞外 以降低產(chǎn)物抑制并利于分離 盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量 以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分離 培養(yǎng)基成分簡單 來源廣 價(jià)格低廉 對溫度 pH 離子強(qiáng)度 剪切力等環(huán)境因素不敏感 對溶氧的要求低 便于培養(yǎng)及降低能耗 微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性 1 個(gè)體簡單 2 繁殖速度快 3 營養(yǎng)需求低 4 培養(yǎng)條件均一 5 代謝類型多樣 6 易于觀測 7 易于調(diào)控 8 易于重組 微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的研究對象 對微生物遺傳規(guī)律的深入研究 不僅促進(jìn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展 而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ) 促使育種工作從自然選育到人工育種 從低效到高效 從隨機(jī)到定向 從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展 研究微生物遺傳學(xué)的意義 遺傳與變異的概念 遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一 遺傳 heredity 親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn) 親代生物傳遞給子代一套實(shí)現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息 特點(diǎn) 具穩(wěn)定性 遺傳型 genotype 又稱基因型 指某一生物個(gè)體所含有的全部基因的總和 是一種內(nèi)在可能性或潛力 遺傳型 環(huán)境條件表型表型 phenotype 指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和 是一種現(xiàn)實(shí)存在 是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀 變異 variation 生物體在外因或內(nèi)因的作用下 遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變 變異的特點(diǎn) a 在群體中以極低的幾率出現(xiàn) 一般為10 6 10 10 b 性狀變化的幅度大 c 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的 可遺傳的 飾變 modification 指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄 翻譯水平上的表型變化 特點(diǎn)是 a 幾乎整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化 b 性狀變化的幅度小 c 因遺傳物質(zhì)不變 故飾變是不遺傳的 引起飾變的因素消失后 表型即可恢復(fù) 例如 粘質(zhì)沙雷氏菌 在25 下培養(yǎng) 產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素 在37 下培養(yǎng) 不產(chǎn)生色素 如果重新將溫度降到25 又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力 遺傳與變異的概念 第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變與誘變育種第三節(jié)基因重組第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退 復(fù)壯與保藏 主要內(nèi)容 第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 種質(zhì)連續(xù)理論 1883 1889年間Weissmann提出 認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物 基因?qū)W說 1933年摩爾根 ThomasHuntMorgan 發(fā)現(xiàn)了染色體 并證明基因在染色體上呈直線排列 提出了基因?qū)W說 使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上 但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成 20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合 可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個(gè)天文數(shù)字 而核酸的組成卻簡單得多 一般僅由4種不同的核苷酸組成 它們通過排列組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸 因此當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因 其活性成分是蛋白質(zhì) DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明 1944年以后 先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)的論證 肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 噬菌體感染試驗(yàn) 病毒的拆開與重建試驗(yàn) 才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì) 1928年 Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn) 1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活對小鼠注射活SIII菌 小鼠死亡對小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌 小鼠死亡抽取心血分離活的SIII菌 一 證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 一 經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) transformation 研究對象 Streptococcuspneumoniae 肺炎鏈球菌 SIII型菌株 有莢膜 菌落表面光滑 有致病性RII型菌株 無莢膜 菌落表面粗糙 無致病性 Griffith轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意 混合培養(yǎng) RII型活菌 SIII型活菌 SIII型熱死菌 RII型活菌 SIII型活菌 健康 健康 健康 健康 健康 健康 健康 病死 病死 病死 2 細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 3 S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn) 以上實(shí)驗(yàn)說明 加熱殺死的SIII型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì) 它能通過某種方式進(jìn)入RII型細(xì)胞并使RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀 轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細(xì)胞 熱死SIII菌 不生長活RII菌 長出RII菌熱死SIII菌 長出大量RII菌和10 6SIII菌 活R菌 S菌無細(xì)胞抽提液 長出大量R菌和少量S菌 活RII菌 平皿培養(yǎng) 加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白質(zhì) 加S菌的莢膜多糖 活R菌 長出S菌 只有R菌 1944年O T Avery C M MacLeod和M McCarty從熱死S型S pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分 并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 只有S型細(xì)菌的DNA才能將S pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型 且DNA純度越高 轉(zhuǎn)化效率也越高 說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的DNA 是遺傳因子 二 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) A D Hershey和M Chase 1952年 1 含32P DNA的一組 放射性85 在沉淀中 上清液中含15 放射性 沉淀中含85 放射性 以35S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 2 含35S 蛋白質(zhì)的一組 放射性75 在上清液中 三 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 為了證明核酸是遺傳物質(zhì) H Fraenkel Conrat 1956 用含RNA的煙草花葉病毒 TMV 進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn) 將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩 就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離 分離后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下 也能感染煙草并使其患典型癥狀 而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子 選用TMV和霍氏車前花葉病毒 HRV 分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì) 將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒 1 RNA TMV 蛋白質(zhì) HRV 2 RNA HRV 蛋白質(zhì) TMV 用兩種雜合病毒感染寄主 1 表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子 2 表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子 上述結(jié)果說明 在RNA病毒中 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸 TMVHRV HRVMTV 一 核酸存在的七個(gè)水平細(xì)胞水平 主要存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體 單核或多核細(xì)胞核水平 原核與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同 核外DNA染色體水平 倍性 真核 和染色體數(shù)核酸水平 在原核中同染色體水平 存在部分二倍體DNA或RNA 復(fù)合或裸露 雙鏈或單鏈基因水平 具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位 轉(zhuǎn)錄 翻譯密碼子水平 信息單位 兼并性和偏愛性 起始和終止核苷酸水平 突變或交換單位 四種堿基 二 遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式 細(xì)胞水平 大部分或全部DNA都集中于細(xì)胞核或核質(zhì)體中 不同種類微生物或同種不同株中細(xì)胞核的數(shù)目不同 染色體水平 真核微生物的每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)含有一定數(shù)量的染色體 而原核微生物中一個(gè)核質(zhì)體就是一個(gè)裸露的環(huán)狀染色體 核外DNA的種類 核外染色體 真核生物的 質(zhì)粒 原核生物的質(zhì)粒 線粒體細(xì)胞質(zhì)基因葉綠體 質(zhì)體 中心體動(dòng)體共生生物 卡巴顆粒酵母菌的2 m質(zhì)粒 F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒 基因 能夠表達(dá)和產(chǎn)生基因產(chǎn)物 蛋白質(zhì)或RNA 的DNA序列 原核生物基因系統(tǒng) 啟動(dòng)子 基因 操縱子操縱子 基因 基因調(diào)控系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因 遺傳密碼 指DNA鏈上各個(gè)核苷酸的特定排列順序密碼子 coden 由3個(gè)核苷酸順序決定 負(fù)載遺傳信息的基本單位不對稱轉(zhuǎn)錄 只有DNA雙鏈的一股作為有意義鏈被轉(zhuǎn)錄 這種現(xiàn)象又稱不對稱轉(zhuǎn)錄 起始密碼子 AUG 甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸終止密碼子 UAA UGA UAG 定義 是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子 能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制 大小 約為2 100 106Dalton 上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因 性質(zhì) 可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在 游離態(tài) 也可以通過重組整合到染色體上 以附加體 episome 的形式存在 二 原核生物的質(zhì)粒 質(zhì)粒是一種復(fù)制子 replicon 根據(jù)自我復(fù)制能力的不同 可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種 嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制 與染色體DNA復(fù)制相伴隨 一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè) 1 5 個(gè)拷貝 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制 在染色體DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制 在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到10 200個(gè)或更多 可以通過轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中 使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí) 它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移 也可以攜帶著染色體 片段 一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移 所以它可成為基因工程的載體 對于細(xì)菌的生存并不是必要的 功能多樣化 功能 進(jìn)行細(xì)胞間接合 并帶有一些基因 如產(chǎn)生毒素 抗藥性 固氮 產(chǎn)生酶類 降解功能等 重組 在質(zhì)粒之間 質(zhì)粒與染色體之間均可發(fā)生 制備 包括增殖 裂解細(xì)胞 分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分 去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟 鑒定 電鏡觀察 電泳 密度梯度離心 限制性酶切圖譜等方法 幾種代表性質(zhì)粒 1 F 因子 fertilityfactor 又稱致育因子或性因子 62 106Dalton 94 5kb 相當(dāng)于核染色體DNA2 的環(huán)狀雙鏈DNA 足以編碼94個(gè)中等大小多肽 其中1 3基因 tra區(qū) 與接合作用有關(guān) 存在于腸細(xì)菌屬 假單胞菌屬 嗜血桿菌 奈瑟氏球菌 鏈球菌等細(xì)菌中 決定性別 R因子由相連的兩個(gè)DNA片段組成 即抗性轉(zhuǎn)移因子 resistencetransforfactor RTF 和抗性決定因子 r determinant RTF為分子量約為11 106Dalton 控制質(zhì)粒copy數(shù)及復(fù)制 抗性決定質(zhì)粒大小不固定 從幾百萬到100 106Dalton以上 其上帶有其它抗生素的抗性基因 R 因子在細(xì)胞內(nèi)的copy數(shù)可從1 2個(gè)到幾十個(gè) 分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種 經(jīng)氯霉素處理后 松弛型質(zhì)?？蛇_(dá)2000 3000個(gè) 細(xì)胞 2 R因子 resistencefactor 產(chǎn)大腸桿菌素因子 大腸桿菌素是由E coli的某些菌株所分泌的細(xì)菌素 能通過抑制復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細(xì)菌 其分子量約4 8 104Dalton 大腸桿菌素都是由Col因子編碼的 Col因子可分為兩類 分別以ColE1和ColIb為代表 ColE1分子量約為5 106Dalton 無接合作用 是多copy的 ColE1研究得很多 并被廣泛地用于重組DNA的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上 ColIb分子量約為80 106Dalton 它與F因子相似 具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能 屬于嚴(yán)緊型控制 只有1 2個(gè)copy 凡帶Col因子的菌株 由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白 從而對大腸桿菌素有免疫作用 不受其傷害 3 Col因子 colicinogenicfactor 只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn) 它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到鈴?fù)雜物質(zhì)的酶編碼 從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)做碳源 這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名 例如有分解CAM 樟腦 質(zhì)粒 XYL 二甲苯 質(zhì)粒 SAL 水楊酸 質(zhì)粒 MDL 扁桃酸 質(zhì)粒 NAP 奈 質(zhì)粒和TOL 甲苯 質(zhì)粒等 4 降解性質(zhì)粒 即誘癌質(zhì)粒 是一種毒性質(zhì)粒 存在于根癌土壤桿菌 Agrobacteriumtumefaciens 中 可引起許多雙子葉植物的根癌 當(dāng)細(xì)菌侵入植物細(xì)胞中后 在其細(xì)胞中溶解 把細(xì)菌的DNA釋放到植物細(xì)胞中 這時(shí) 含有復(fù)制基因的Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合 破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng) 從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞 Ti質(zhì)粒長200kb 是一個(gè)大型質(zhì)粒 當(dāng)前 Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體 一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中 并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上 以改變該植物的遺傳性 達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的 5 Ti質(zhì)粒 tumorinducingplasmid 是近年來在Rhizobium 根瘤菌屬 中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒 分子量為200 300 106Dalton 比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍 故稱巨大質(zhì)粒 其上有一系列固氮基因 6 巨大質(zhì)粒 mega質(zhì)粒 第二節(jié)基因突變和誘變育種 突變 mutation 指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化 染色體畸變 細(xì)胞學(xué)上可以看到染色體的變化突變基因突變 細(xì)胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變化突變體 mutant 發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株野生型 wildtype 從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株 依表型的改變分為 形態(tài)突變型 營養(yǎng)缺陷型 因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力 并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型 發(fā)酵突變型 喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型 因突變而產(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型 突變后在某種條件下可正常生長繁殖 而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型 因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型 一 基因突變的類型 按是否比較容易 迅速地分離到發(fā)生突變的細(xì)胞來分 選擇性突變株 selectivemutant 具有選擇標(biāo)記 如營養(yǎng)缺陷性 抗性突變型 條件致死突變型 只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件 如培養(yǎng)基 溫度 pH值等 就比較容易檢出和分離到 非選擇性突變株 non selectivemutant 無選擇標(biāo)記 如產(chǎn)量突變型 抗原突變型 形態(tài)突變型 能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異 定義 每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的機(jī)率 突變率為10 8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中 會(huì)發(fā)生一次突變 突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株 mutant 即突變型 的數(shù)目來表示 如一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體 當(dāng)其分裂為2 108個(gè)細(xì)胞時(shí) 即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10 8 突變率 突變細(xì)胞數(shù) 分裂前群體細(xì)胞數(shù)突變是獨(dú)立的 某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其它基因的突變率 在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的 因?yàn)殡p重突變型的幾率只是各個(gè)突變幾率的乘積 由于突變的機(jī)率一般都極低 因此 必須采用檢出選擇性突變株的手段 尤其是采用檢出營養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)突變株或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來加以確定 二 突變率 若干細(xì)菌某一性狀的自發(fā)突變率 菌名突變性狀突變率E coli抗T1噬菌體3 10 8E coli抗T3噬菌體1 10 7E coli不發(fā)酵乳糖1 10 10E coli抗紫外線1 10 5Staphylococcusaureus抗青霉素1 10 7S aureus抗鏈霉素1 10 9Salmonellatyphi抗25 g L鏈霉素1 10 6Bacillusmegaterium抗異煙肼5 10 5 三 突變的特點(diǎn) 適用于整個(gè)生物界 以細(xì)菌的抗藥性為例 不對應(yīng)性 突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系 自發(fā)性 突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生 稀有性 突變率低且穩(wěn)定 獨(dú)立性 各種突變獨(dú)立發(fā)生 不會(huì)互相影響 可誘發(fā)性 誘變劑可提高突變率 穩(wěn)定性 變異性狀穩(wěn)定可遺傳 可逆性 從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變 從突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變或回變 四 基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明 在各種基因突變中 抗性突變最為常見 但在過去相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈 一種觀點(diǎn)認(rèn)為 突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的 即各種抗性是由其環(huán)境 指其中所含的抵抗對象 誘發(fā)出來的 突變的原因和突變的性狀間是相對應(yīng)的 并認(rèn)為這就是 定向變異 也有人稱它為 馴化 或 馴養(yǎng) 另一種看法則認(rèn)為 基因突變是自發(fā)的 且與環(huán)境是不相對的 由于其中有自發(fā)突變 誘發(fā)突變 誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起 所以難以探究問題的實(shí)質(zhì) 從1943年起 經(jīng)過幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題 終于解決了這場紛爭 1 變量試驗(yàn) 2 涂布試驗(yàn) 涂布試驗(yàn)中突變率的計(jì)算 初始接種量 5 104個(gè) 皿培養(yǎng)5小時(shí) 繁殖了12 3代 每個(gè)微菌落約含5100個(gè)細(xì)菌這時(shí) 每個(gè)平皿上的細(xì)胞數(shù)為 5100 5 104 2 6 108個(gè) 皿在6個(gè)平板上 比接種時(shí)增加的細(xì)胞數(shù)為 6 2 6 108 5 104 15 6 108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變 故突變率 28 15 6 108 1 8 10 8 3 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn) replicaplating 1952年 J Lederberg夫婦的論文 平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇 更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的 這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干 平板影印培養(yǎng)法 是一種能達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培養(yǎng)方法 把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上 使其沾上來自平板上的菌落 然后可把這一 印章 上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上 待這些平板培養(yǎng)后 對各平板相同位置上的菌落作對比后 就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途?據(jù)報(bào)道 用此法可把母平板上10 20 量的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到絲絨布上 并可利用這一 印章 接種8個(gè)子培養(yǎng)皿 因此 通過影印培養(yǎng)法 就可以從在非選擇性條件下生長的細(xì)菌群體中 分離出各種類型的突變株 平板影印培養(yǎng)法 在根本未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下 就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株 充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的 鏈霉素只是起到了一種檢出作用 平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應(yīng)用 而且在育種時(shí)間和其它研究中均有應(yīng)用 值得很好地領(lǐng)會(huì) 五 基因突變的機(jī)制 基因突變的原因是多種多樣的 可以是自發(fā)的或誘發(fā)的 誘變又可分為點(diǎn)突變和畸變 具體類型可歸納如下 1 誘變機(jī)制 誘變劑 mutagen 凡能提高突變率的任何理化因子 就稱為誘變劑種類 誘變劑的種類很多 作用方式多樣 即使是同一種誘變劑 也常有幾種作用方式 按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)討論幾種有代表性的誘變劑的作用機(jī)制 1 堿基置換 substitution 定義 對DNA來說 堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷 microlesion 一般也稱點(diǎn)突變 pointmutation 它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換 分類 轉(zhuǎn)換 transition 即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換 顛換 transversion 即一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶 或是一個(gè)嘧啶被一個(gè)嘌呤所置換 對某一具體誘變劑來說 即可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換 也可只具其中的一種功能 根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換 可把置換的機(jī)制分成以下兩類來討論 直接引起置換的誘變劑 定義 一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑 不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用 種類 很多 例如亞硝酸 羥胺和各種烷化劑 硫酸二乙酯 甲基磺酸乙酯 N 甲基 N 硝基 N 亞硝基胍 N 甲基 N 亞硝基脲 乙烯亞胺 環(huán)氧乙酸 氮芥等 作用 它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對的轉(zhuǎn)換 并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異 羥胺只引起G C A T 其余都是可使G C A T發(fā)生互變的 能引起顛換的誘變劑很少 只是部分烷化劑才有 參見下表 若干誘變劑的作用機(jī)制及誘變功能 誘變因素在DNA上的初級效應(yīng)遺傳效應(yīng)堿基類似物摻入作用AT GC雙向轉(zhuǎn)換羥胺與胞嘧啶起反應(yīng)GC AT的轉(zhuǎn)換亞硝酸A G C的氧化脫氨作用AT GC雙向轉(zhuǎn)換交聯(lián)缺失烷化劑烷化堿基 主要是G AT GC雙向轉(zhuǎn)換烷化磷酸基團(tuán)AT TA的顛換喪失烷化的嘌呤GC CG的顛換糖 磷酸骨架的斷裂巨大損傷 缺失 重復(fù) 倒位 易位 丫啶類堿基之間的相互作用 雙鏈變形 碼組移動(dòng) 或 紫外線形成嘧啶的水合物GC AT轉(zhuǎn)換形成嘧啶的二聚體碼組移動(dòng) 或 交聯(lián)電離輻射堿基的羥基化核降解AT GC雙向轉(zhuǎn)換DNA降解碼組移動(dòng) 或 糖 磷酸骨架的斷裂巨大損傷 缺失 重復(fù) 倒位 易位 喪失嘌呤加熱C脫氨基CG TA轉(zhuǎn)換Mu噬菌體結(jié)合到一個(gè)基因中間碼組移動(dòng) 亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用 HNO2胞嘧啶 C 尿嘧啶 U HNO2腺嘌呤 A 次黃嘌呤 H HNO2鳥嘌呤 G 黃嘌呤 X 這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響 主要是使堿基對發(fā)生轉(zhuǎn)換 堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制 以亞硝酸為例 腺嘌呤 A 變成次黃嘌呤 H 后引起的轉(zhuǎn)換過程 腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤 He He通過互變異構(gòu)效應(yīng)形成酮式次黃嘌呤 HK DNA復(fù)制時(shí) HK與胞嘧啶 C 配對 DNA第二次復(fù)制時(shí) C與G正常配對 實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)換 亞硝酸引起的AT GC轉(zhuǎn)換細(xì)節(jié) 這類誘變劑主要是一些堿基類似物 如 5 溴尿嘧啶 5 BU 和5 氨基尿嘧啶 5 AU 疊氮胸腺嘧啶 AIT 等等 作用方式 通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)參入到DNA分子中 主要是在DNA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入DNA中 引起堿基對配對錯(cuò)誤 造成堿基置換 以5 溴尿嘧啶 5 BU 為例 5 BU是胸腺嘧啶 T 的的類似物 酮式的5 BU可以和A配對 烯醇式的5 BU可以和G配對 在DNA分子復(fù)制的過程中 由于5 BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換 間接引起置換的誘變劑 5 BU引起的轉(zhuǎn)換 5 BU引起的轉(zhuǎn)換 從上圖中 還可以看到5 BU的摻入引起的G C回復(fù)到A T的過程 通過這兩個(gè)圖示 就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變 又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的原因了 也可以知道 為什么像5 BU這類代謝類似物只有對正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用 而對休止細(xì)胞 游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用 2 移碼突變 frame shiftmutation或phase shiftmutation 指誘變劑使DNA分子中增加 插入 或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸 從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變 由移碼突變所產(chǎn)生的突變株 稱為移碼突變株 frame shiftmutant 與染色體畸變相比 移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷 丫啶類染料 包括原黃素 丫啶黃 丫啶橙和 氨基丫啶等 以及一系列稱為ICR類的化合物 都是移碼突變的有效誘變劑 圖8 14 能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物 引起移碼突變的誘變劑 主要是吖啶類染料 如吖啶黃 吖啶橙等等 這類化合物都是平面型的三環(huán)分子 它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤 嘧啶對十分相似 丫啶類化合物的誘變機(jī)制 至今還不很清楚 有人認(rèn)為 由于它們是一種平面型三環(huán)分子 結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤 嘧啶對十分相似 故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對之間 造成雙螺旋的部分解開 兩個(gè)堿基對原來相距0 34nm 當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí) 就變成0 68nm 從而在DNA復(fù)制過程中 會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基 結(jié)果就引起了移碼突變 丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示 3 染色體畸變 chromosomalaberration 某些理化因子 如X射線等的輻射及烷化劑 亞硝酸等 除了能引起點(diǎn)突變外 還會(huì)引起DNA的大損傷 macrolesion 染色體畸變 它包括 染色體結(jié)構(gòu)上的變化 缺失 deletion 重復(fù) duplication 易位 translocation 倒位 inversion 染色體數(shù)目的變化 染色體結(jié)構(gòu)上的變化 分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類 染色體內(nèi)畸變 只涉及一條染色體上的變化 如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時(shí) 其結(jié)果可造成基因的減少或增加 如發(fā)生倒位或易位時(shí) 則可造成基因排列順序的改變 但數(shù)目卻不改變 倒位 是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn)180 后 重新插入到原來染色體的原位置上 從而使其基因順序與其它的基因順序相反 易位 是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上 染色體間畸變 指非同源染色體間的易位 染色體畸變 轉(zhuǎn)座因子 transposibleelement 由40年代B McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位 自1967年以來 已在微生物和其它生物中得到普遍證實(shí) 并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn) 舊概念 基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動(dòng)的核苷酸片段 新發(fā)現(xiàn) 有些DNA片段不但可在染色體上移動(dòng) 還可從一個(gè)染色體跳到另一個(gè)染色體 從一個(gè)質(zhì)粒跳到另一個(gè)質(zhì)粒或染色體 甚至還從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞 在這些DNA順序的跳躍過程中 往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接 從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉 結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生 轉(zhuǎn)座因子 transposibleelement 在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序 也稱作跳躍基因 jumpinggene 或可移動(dòng)基因 movablegene 轉(zhuǎn)座因子的種類 1 插入序列 IS insertionsequence 特點(diǎn)是分子量最小 僅0 7 1 4kb 只能引起轉(zhuǎn)座 transposition 效應(yīng)而不含其它基因 可以在染色體 F因子等質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)它們 已知的IS有5種 即IS1 IS2 IS3 IS4和IS5 E coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS 如IS2 IS3等 通過這些同源序列間的重組 就可使F因子插入到E coli的核染色體組上 從而使后者成為Hfr菌株 因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同 其引起的突變效應(yīng)也不同 IS引起的突變可以回復(fù) 其原因可能是IS被切離 如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列 就會(huì)在插入部位造成缺失 從而發(fā)生新的突變 轉(zhuǎn)座因子的種類 2 轉(zhuǎn)座子 Tn transposon 又稱轉(zhuǎn)位子 易位子 IS和Mu噬菌體相比 Tn的分子量是居中的 一般為2 25kb 它含有幾個(gè)至十幾個(gè)基因 其中除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外 還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因 Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點(diǎn)上 但這些位點(diǎn)似乎也不完全是隨機(jī)的 其中某些區(qū)域更易插入 轉(zhuǎn)座因子的種類 3 Mu噬菌體 即mutatorphage 誘變噬菌體 它是E coli的一種溫和噬菌體 與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同 Mu噬菌體并沒有一定的整合位置 與以上的IS和Tn兩種轉(zhuǎn)座因子相比 Mu噬菌體的分子量最大 37kb 它含有20多個(gè)基因 Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變 其中約有2 是營養(yǎng)缺陷型突變 2 自發(fā)突變機(jī)制 自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變 幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng) 過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物 它對Neurospora 脈孢菌 有誘變作用 這種作用可因同時(shí)加入過氧化氫酶而降低 如果在加入該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑KCN 則又可提高突變率 這就說明 過氧化氫很可能是 自發(fā)突變 中一種內(nèi)源性誘變劑 在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株 可能也是同樣的原因 互變異構(gòu)效應(yīng) 堿基T G的第六位上是酮基 會(huì)以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)C A的第六位上是氨基 會(huì)以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式 在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A T和G C堿基配對的形式出現(xiàn)在偶然情況下 在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間 在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時(shí) 其相對位置上就出現(xiàn)G同樣 如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間 則在新合成DNA單鏈中與C相對應(yīng)的位置上就將是A 這可能就是發(fā)生相應(yīng)的自發(fā)突變的原因 要預(yù)言在某一時(shí)間 某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不可能的 在運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對這些偶然事件做大量統(tǒng)計(jì)分析后 可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律 例如 據(jù)統(tǒng)計(jì) 堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10 8 10 9 環(huán)出效應(yīng) 即環(huán)狀突出效應(yīng) 有人提出 在DNA的復(fù)制過程中 如果其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個(gè)小環(huán) 則會(huì)因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失 從而造成自發(fā)突變 下圖就是環(huán)出效應(yīng)的設(shè)想機(jī)制 在上鏈中 標(biāo)記B處發(fā)生 環(huán)出 故只有A及C能獲得復(fù)制 從而發(fā)生自發(fā)突變 而在下鏈中 復(fù)制仍正常進(jìn)行 六 紫外線對DNA的損傷及其修復(fù) 已知的DNA損傷類型很多 機(jī)體對其修復(fù)的方式也各異 發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線 U V ultravioletray 的作用 嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多 嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物 其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除 紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體 二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用 并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形 阻礙堿基間的正常配對 從而有可能引起突變或死亡 在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少 但一旦形成 就會(huì)妨礙雙鏈的解開 因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 并使細(xì)胞死亡 光復(fù)活作用 photoreactivation 定義 經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí) 可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象 稱為光復(fù)活作用 這一現(xiàn)象最早是A Kelner 1949 在Strepotomycesgriseus 灰色鏈霉菌 中發(fā)現(xiàn)的 后來 在許多微生物中都得到了證實(shí) 最明顯的是在E coli的實(shí)驗(yàn)中 對照 8 106個(gè) mlE coliU V 100個(gè) mlE coli試驗(yàn) 8 106個(gè) mlE coliU V 360 490nm2 106個(gè) mlE coli可見光 30分經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子 在黑暗下會(huì)被一種光激活酶 photoreactivatingenzyme 即光裂合酶 photolyase 結(jié)合 當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光 300 500nm 下時(shí) 此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離 從而使二聚體重新分解成單體 與此同時(shí) 光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來 以便重新執(zhí)行功能 每一E coli細(xì)胞中約含有25個(gè)光激活酶分子 由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用 所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí) 只能在紅光下照射及處理照射后的菌液 圖 光復(fù)活作用 暗修復(fù)作用 darkrepair 又稱切除修復(fù) excisionrepair 是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑 包括烷化劑 X射線和 射線等 損傷后的DNA的機(jī)制 這種修復(fù)作用與光無關(guān) 有四種酶參與 內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5 一側(cè)切開一個(gè)3 OH和5 P的單鏈缺口 外切核酸酶從5 P至3 OH方向切除二聚體 并擴(kuò)大缺口 DNA聚合酶以DNA的另一條互補(bǔ)鏈為模板 從原有鏈上暴露的3 OH端起逐個(gè)延長 重新合成一段缺失的DNA鏈 通過連接酶的作用 把新合成的寡核苷酸的3 OH末端與原鏈的5 P末端相連接 從而完成了修復(fù)作用 暗修復(fù)作用 darkrepair 1 由核酸內(nèi)切酶切開二聚體的5 末端 形成3 OH和5 P的單鏈缺口2 核酸外切酶從5 P到3 OH方向切除二聚體 并擴(kuò)大缺口 3 DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板 從原有鏈上暴露的3 OH端起合成缺失片段 4 連接酶將新合成的3 OH與原有的5 P相連接 紫外誘變方法 設(shè)備 紫外燈 磁力攪拌器 暗室等 紫外燈 波長為253 7nm 功率是15W處理時(shí)的照射距離 20cm 30cm樣品 要直接暴露在紫外燈下 厚度不能超過3mm照射時(shí) 要用磁力攪拌器攪拌 處理劑量 常用照射時(shí)間或死亡率作為相對劑量 由于微生物接受的照射劑量與燈的功率 照射距離 照射時(shí)間 菌液濃度 菌液厚度 細(xì)胞本身特性等因素有關(guān) 所以單純用時(shí)間表示照射劑量并不完全可靠 一定的死亡率必定對應(yīng)一定的照射劑量 所以 在實(shí)際應(yīng)用中 用死亡率表示照射劑量更可靠 通常先繪制照射時(shí)間與死亡率的關(guān)系曲線 然后選擇合適的劑量 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量 死亡率為70 80 左右 重組修復(fù) 必須在DNA復(fù)制的情況下進(jìn)行 所以又叫復(fù)制后修復(fù) 細(xì)胞在不切除二聚體的情況下 以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補(bǔ)單鏈 但在每個(gè)二聚體附近留有一空隙 通過染色體交換 空隙部位就不在面對著胸腺嘧啶二聚體 而是面對著正常的單鏈 在這種條件下 DNA聚合酶和連接酶起作用將空隙部位進(jìn)行修復(fù) 重組修復(fù)中的DNA損傷并沒有去除 但隨著微生物的傳代繁殖 損傷的比例逐漸降低 誘變育種 是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì) DNA 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法 誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義 當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株 幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的 七 誘變育種 誘變育種的步驟 原始菌種 純化 斜面 肉湯培養(yǎng) 單孢子 單細(xì)胞懸液 誘變劑處理 平板分離 移至斜面 小試 中試 初篩 復(fù)篩 計(jì)算存活率 觀察形態(tài)變異 挑單菌落 良種保藏 原菌種特性鑒定 誘變育種的基本過程 選擇選擇合適的出發(fā)菌株 制備待處理的菌懸液 誘變處理 篩選 保藏和擴(kuò)大試驗(yàn) 1 出發(fā)菌株的選擇 出發(fā)菌株 用來育種處理的起始菌株 出發(fā)菌株應(yīng)具備 對誘變劑的敏感性高 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力 出發(fā)菌株的來源 自然界直接分離到的野生型菌株 歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 2 制備細(xì)胞懸液要求 菌體處于對數(shù)生長期 并使細(xì)胞處于同步生長 細(xì)胞分散且為單細(xì)胞 以避免表型遲延現(xiàn)象 方法 玻璃珠打散10 15min 加 3 吐溫80 表面活性劑 用無菌脫脂棉過濾 制備 物理誘變劑 生理鹽水 0 85 NaCl 化學(xué)誘變劑 緩沖液濃度 細(xì)菌 放線菌108個(gè) ml霉菌 酵母菌106個(gè) ml 表型遲延現(xiàn)象 指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后 才在表型上顯示出來 造成不純的菌落 產(chǎn)生原因 分離性遲延現(xiàn)象 生理性遲延現(xiàn)象 3 誘變處理 誘變劑的作用 提高突變的頻率 擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動(dòng)劑量的表示法 不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同 所以在誘變處理前 一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線 選擇合適的處理劑量 致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法 最適劑量的選擇 產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量 致死率在70 80 誘變劑劑量 一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積 各種誘變劑有不同的劑量表示方式 如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來表示 在育種實(shí)踐中 常以殺菌率來作誘變劑的相對劑量 誘變劑的合適劑量 凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上 能擴(kuò)大變異幅度 促使變異移向正變范圍的劑量 就是合適的劑量 要確定一個(gè)合適的劑量 常常要經(jīng)過多次試驗(yàn) 就一般微生物而言 在一定的劑量范圍內(nèi) 突變率往往隨劑量的增高而提高 但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中 而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中 還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中 更容易出現(xiàn)負(fù)變 因此 在誘變育種工作中 目前大家比較傾向于采用較低的劑量 選擇誘變劑的種類 在選用理化因子作誘變劑時(shí) 在同樣效果下 應(yīng)選用最方便的因素 而在同樣方便的情況下 則應(yīng)選擇最高效的因素 在物理誘變劑中 尤以紫外線為最方便 而在化學(xué)誘變劑中 一般可選用誘變效果最為顯著的 超誘變劑 如NTG 簡便有效的誘變方法 紫外線的照射最為方便 化學(xué)誘變劑的種類 濃度和處理方法尤其是中止反映的方法很多 實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書籍 一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是 先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞 然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒 也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片 經(jīng)培養(yǎng)后 在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落 分別制成懸浮液 然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落 最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種 常用誘變劑的使用方法 4 菌種篩選 4 1篩選方案 實(shí)際工作中 為了提高篩選效率 往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行 初篩的目的 刪去明確不符合要求的大部分菌株 把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來 使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng) 因此 初篩工作以量為主 測定的精確性還在其次 初篩手段應(yīng)盡可能快速 簡單 復(fù)篩的目的 確認(rèn)符合要求的菌株 復(fù)篩以質(zhì)為主 應(yīng)精確測定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo) 篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟 可見 設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法極其重要 以選育高產(chǎn)突變株為例 誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下 4 2變異菌的一般篩選方法 4 2 1平皿快速檢測法變色圈法透明圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法4 2 2搖瓶培養(yǎng)法 4 3特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變抗性突變 以溫度敏感突變?yōu)槔?篩選方法 用途 常用于提高代謝物產(chǎn)量原因 是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后 在高溫下活力喪失重要性 如果此酶為蛋白質(zhì) 核酸合成途徑中所需的酶 則此變異株在高溫下的表型就是營養(yǎng)缺陷型 4 3 1條件抗性突變型的篩選 舉例 由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256 經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88 30 培養(yǎng)時(shí)能正常生長40 是死亡 但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸 而野生型卻受生物素的反饋抑制 在富含生物素的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí) 先在30 允許條件 中進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量菌細(xì)胞 適當(dāng)時(shí)間后提高溫度 40 非允許條件 即能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn) 方法 梯度平板法 gradientplate 4 3 2抗藥性突變株的篩選 抗藥性突變株的應(yīng)用 作為菌株的遺傳標(biāo)記作為生產(chǎn)菌種 結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株 4 3 3抗生素抗性變異株的篩選 與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體 營養(yǎng)缺陷型 經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷 而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株 如 lys bio 野生型 自然界分離到的任何微生物 在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株 為該微生物的野生型 如 lys bio 原養(yǎng)型 指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株 與野生型的表型相同 4 3 4營養(yǎng)缺陷型 auxotroph 的篩選 與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 MM 凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基 完全培養(yǎng)基 CM 滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基 補(bǔ)充培養(yǎng)基 SM x 在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基 營養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法 auxo的鑒定 誘變處理 auxo的濃縮 auxo的檢出 缺陷型的濃縮 抗生素法原理 青霉素 制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細(xì)胞 對休止態(tài)細(xì)胞無作用 方法 將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中 菌絲過濾法 適用于 絲狀 放線菌 霉菌 原理 基本培養(yǎng)基上只有野生型發(fā)育成菌絲 auxo孢子可通過濾膜 野生型菌絲不能通過 逐個(gè)檢出法 缺陷型的檢出 影印平板培養(yǎng)法 夾層培養(yǎng)法 生長譜法方法簡便 回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片 缺陷型的鑒定 測定一般應(yīng)分兩階段 第一階段 測定是哪類物質(zhì)的缺陷型 第二節(jié)段 根據(jù)第一階段確定的范圍 進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的缺陷型 組合營養(yǎng)物法 步驟 以氨基酸缺陷型的鑒定為例 a 將多種營養(yǎng)因子編組 b 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng) c 結(jié)果分析 如 一組 12345二組 26789三組 37101112四組 48111314五組 59121415 營養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意 1 每組內(nèi)無重復(fù)的營養(yǎng)因子2 每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子3 每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次 一組 12345二組 26789三組 37101112四組 48111314五組 59121415 缺陷型的應(yīng)用 作為菌株的遺傳標(biāo)記 進(jìn)行基因工程 誘變育種 研究代謝過程時(shí)用作親本標(biāo)記 作為生產(chǎn)菌種 aa 核苷酸等生產(chǎn)菌種 作為aa 維生素 堿基的測定菌株 Amestest 對化學(xué)誘變劑做檢測 菌種 鼠傷寒沙門氏菌his 原理 his 在基本培養(yǎng)基上不長 而發(fā)生回復(fù)突變則長 Amestest方法示意圖 第三節(jié)基因重組 定義 凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起 經(jīng)過遺傳分子間的重新組合 形成新遺傳型個(gè)體的方式 稱為基因重組 generecombination 或遺傳重組 作用 重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下 也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體 重組與雜交的關(guān)系 重組是分子水平上的一個(gè)概念 可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交 而一般所說的雜交 hybridization 則是細(xì)胞水平上的一個(gè)概念 雜交中必然包含著重組 而重組則不限于雜交這一形式 真核微生物中的有性雜交 準(zhǔn)性雜交 parasexualhybridization 等及原核生物中的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映 微生物中各種形式基因重組的比較 重組范圍整套染色體局部雜合供體和受體的關(guān)系高頻率低頻率部分染色體個(gè)別或少數(shù)基因細(xì)胞融合性細(xì)胞真菌的有性生殖或聯(lián)結(jié)體細(xì)胞真菌的準(zhǔn)性生殖細(xì)胞間暫時(shí)溝通細(xì)菌的接合性導(dǎo)細(xì)胞間吸收游離DNA片段轉(zhuǎn)化不接觸噬菌體攜帶DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體完整噬菌體溶源轉(zhuǎn)變提供遺噬菌體DNA轉(zhuǎn)染傳物質(zhì) 基因重組的意義 基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ) 雜交育種的優(yōu)點(diǎn) 由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本 因此 不論在方向性還是自覺性方面 均比誘變育種前進(jìn)了一大步 利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象 因此 它是一種重要的育種手段 雜交育種的缺點(diǎn) 由于雜交育種的方法較復(fù)雜 工作進(jìn)展較慢 還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和使用 尤其在原核生物的領(lǐng)域中 應(yīng)用轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見 到了70年代后期 由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后 才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展 甲生長快 產(chǎn)量低 乙生長慢 產(chǎn)量高 基因重組 如 生長快 產(chǎn)量高 一 原核微生物的基因重組 基因重組的方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合原生質(zhì)體融合 R型活菌 S型死菌 S型活菌定義 受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來自供體菌的游離DNA片段 并把它整合到自己的基因組中 而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程 稱為轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子 transformant 有關(guān)名詞 受體菌 recipient receptor 轉(zhuǎn)化基因的接受者供體菌 donor 轉(zhuǎn)化基因的提供者轉(zhuǎn)化因子 來自供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)化子 transformant 將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子 一 轉(zhuǎn)化 transformation 1 轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn) 受體細(xì)胞要處于感受態(tài) 感受態(tài) competence 受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài) 供體DNA片段 轉(zhuǎn)化因子 大小適宜 分子量一般為1 107D左右 菌株間的親緣關(guān)系密切 2 轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件 3 轉(zhuǎn)化的類型 根據(jù)感受態(tài)建立的方式 可以分為 自然遺傳轉(zhuǎn)化naturalgenetictransformation 人工轉(zhuǎn)化artificialtransformation 感受態(tài) 出現(xiàn)時(shí)間 只在細(xì)菌生長的某一時(shí)期出現(xiàn) 不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長時(shí)期感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定 但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響 cAMP Ca2 等最明顯 如用CaCl2處理E coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài) 感受態(tài)細(xì)胞的比例 當(dāng)處于感受態(tài)高峰時(shí) 群體中呈感受態(tài)的細(xì)胞因菌種而不同 轉(zhuǎn)化DNA的最低濃度 在群體中含有15 感受態(tài)細(xì)胞時(shí) 0 1 gDNA ml細(xì)胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化 感受態(tài)因子 細(xì)胞外蛋白 可能存在于細(xì)胞膜上 可催化外來DNA分子的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分 以讓細(xì)胞表面的DNA受體顯露出來 也可能是一種自溶酶 對不同細(xì)菌 每個(gè)細(xì)胞上的DNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)不同 轉(zhuǎn)化因子 轉(zhuǎn)化因子 本質(zhì)是供體DNA片段一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA 也有少數(shù)報(bào)道認(rèn)為線狀單鏈DNA