飼料發(fā)酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數(shù)量變化的影響.doc

飼料發(fā)酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數(shù)量變化的影響摘 要：以植物乳桿菌和大腸桿菌 E.colik88 為指示菌株，研究了飼料的液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵兩種工藝在 20 與 30 兩種溫度下的 pH 值變化及菌數(shù)的動態(tài)變化。結(jié)果表明：30 溫度下，物料的酸度變化（pH 值）比 20 溫度時下降的速度快、幅度大；在固態(tài)發(fā)酵過程中，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵的起始 pH 值低于固態(tài)發(fā)酵（P0.05），但液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵在發(fā)酵過程中 pH 值差異不顯著(P0.05)；在 30 的發(fā)酵溫度下，乳酸細菌數(shù)呈先增值后下降趨勢，但液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵之間差異不顯著(P0.05)；在液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝下，大腸桿菌 E.colik88 菌數(shù)呈直線下降趨勢，而在固態(tài)發(fā)酵工藝下，大腸桿菌 E.colik88 菌數(shù)呈先升后降，證實液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)工藝對原料中大腸桿菌直接產(chǎn)生抑菌作用。關(guān)鍵詞：益生菌；發(fā)酵工藝；乳酸菌數(shù)；抑菌特性隨著飼料中抗生素類生長促進劑在歐盟的全面禁用，飼料微生物發(fā)酵技術(shù)在動物生產(chǎn)中受到高度重視，歐盟已實現(xiàn)廣泛應(yīng)用。飼喂微生物發(fā)酵飼料有提高動物生長性能和改善腸道健康的作用（Scholten 等，1999；Canibe 等 2007），荷蘭至少有 50的豬在飼喂發(fā)酵飼料，丹麥有 30以上的母豬飼喂發(fā)酵飼料，母豬泌乳期的使用更達 70%以上。另外，法國、瑞典、西班牙也陸續(xù)開始使用微生物發(fā)酵飼料。飼料發(fā)酵目前主要采用液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種工藝，液態(tài)發(fā)酵（Submerged Fermentation,SmF）具有周期短、易控制、微生物的繁殖重復(fù)性強等優(yōu)點，但需要配套昂貴的系統(tǒng)設(shè)備，難以被大眾所接受；固態(tài)發(fā)酵（Solid StateFermentation,SSF）具有培養(yǎng)基簡單，基料來源廣泛；投資少，能耗低，操作方便等優(yōu)點，但勞動強度大，難以與現(xiàn)實規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)所需的系列化日糧配合加工結(jié)合。為此，本課題設(shè)計飼料液態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵新工藝并展開了系列研究。試驗以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 和致病性大腸桿菌 E.colik88 為指示菌株，研究在液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵飼料中目標益生菌和指示菌的動態(tài)變化情況，為建立適合我國養(yǎng)殖生產(chǎn)條件的生物發(fā)酵飼料新工藝提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 菌株來源植物乳桿菌由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存；大腸桿菌 E.colik88 購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。1.1.2 培養(yǎng)基選擇及菌株培養(yǎng)參照何濤等介紹的方法，植物乳桿菌采用 MRS培養(yǎng)基，大腸桿菌 E.colik88 采用伊紅美蘭培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.1.3 主要儀器設(shè)備超凈工作臺（蘇州安泰 SW-CJ-1CU 型）、酸度計(上海理達 PHS-25C 型)、高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安ZDX-35BI 型）、恒溫培養(yǎng)箱 （黃石恒豐 SP-01 型）、微型發(fā)酵瓶(罐頭瓶)。1.1.4 發(fā)酵基料設(shè)計原則以生長后期仔豬配合飼料為發(fā)酵的基礎(chǔ)原料，即不含預(yù)混料的配合飼料（配方見表 1）。在此基礎(chǔ)上，制備如下三種發(fā)酵基料，固態(tài)發(fā)酵基料：為不含微量元素、維生素、礦物質(zhì)的配合飼料；液態(tài)發(fā)酵基料：玉米、豆粕按質(zhì)量分數(shù) 1： 3 混合均勻；液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵基料：為固態(tài)發(fā)酵基料中減去液態(tài)發(fā)酵基料的部分。飼料工業(yè)2011 年第 32 卷第 5 期試 驗 研 究30表 1 固態(tài)發(fā)酵基料配方原料名稱玉米豆粕魚粉麩皮膨化大豆比例（%）66183581.2 試驗方法1.2.1 試驗設(shè)計與方案采用 2 因子試驗設(shè)計。研究了2 種發(fā)酵溫度（20 ，T1；30 ，T2）下，不同發(fā)酵工藝（液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵）對 pH 值及菌落數(shù)的影響，設(shè)計方案見表 2。表 2 設(shè)計方案發(fā)酵溫度T1（20）T2（30）發(fā)酵工藝液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵1.2.2 試驗操作方法1.2.2.1 液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝操作方法第一階段（液態(tài)發(fā)酵）：稱取 20 g 液態(tài)發(fā)酵基料于微型發(fā)酵瓶中，以料水比 1： 3.5 加入 70 g 水，按106cfu/g 物料接入植物乳桿菌，在 25 的恒溫條件下靜置培養(yǎng) 48 h。第二階段（固態(tài)發(fā)酵）：直接在液態(tài)發(fā)酵料中加入80 g 的固態(tài)配合料，攪拌均勻，使終水分在 40%左右。并按每 106cfu/g 物料接種 E.colik88，密封置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.2.2 固態(tài)發(fā)酵工藝操作方法與液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝的第二個階段同時進行，具體操作如下：稱取 20 g 液態(tài)發(fā)酵基料和 80 g 的固態(tài)配合料于微型發(fā)酵瓶中，加入一定質(zhì)量的水，使終水分在 40%左右，按 106cfu/g 物料分別接種植物乳桿菌和 E.colik88，攪拌均勻，密封置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.3 指標測定分別于固態(tài)發(fā)酵開始后第 0、24、48、72、120、168 h無菌取樣，進行 pH 值和微生物的測定。pH 值測定：取鮮樣 10 g，用 100 ml 蒸餾水浸提 12 min 后，經(jīng)紗布過濾，水浸液當(dāng)即用酸度計測定 pH值。微生物測定采用 10 倍稀釋法，植物乳桿菌測定應(yīng)用 MRS 瓊脂培養(yǎng)基，37 培養(yǎng) 36 h，大腸桿菌 E.colik88 測定采用 EMB 培養(yǎng)平板，37 培養(yǎng) 24 h。1.3 數(shù)據(jù)處理微生物及 pH 值數(shù)據(jù)采用 SAS6.12 的 t-test 過程進行兩組均數(shù)的差異顯著性檢驗。2 結(jié)果與分析2.1 發(fā)酵過程中 pH 值的動態(tài)變化2.1.1 不同發(fā)酵工藝對 pH 值的影響（見表 3）在發(fā)酵過程中，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵起始（0 h）pH 值明顯優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵，差異顯著（P0.05）。在隨后的發(fā)酵時間里，2 個發(fā)酵溫度下，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵 pH 值差異都不顯著(P0.05)。這主要是因為液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝中接種的益生菌株植物乳桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機酸成分，在液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵時直接降低了飼料的 pH 值。因而隨著發(fā)酵時間的延長，pH 值趨向一致，所以差異不顯著。2.1.2 不同發(fā)酵溫度對 pH 值的影響（見圖 1）76543210pH值0 2448 72 120168液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T1液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T2固態(tài)發(fā)酵 T1固態(tài)發(fā)酵 T2時間（h）圖 1 不同發(fā)酵溫度對 pH 值的影響1684.050.05a3.960.04a3.940.03a4.010.02a表 3 不同發(fā)酵處理對 pH 值的影響05.820.02a6.400.03b5.820.02a6.400.03b244.540.10a4.490.01a4.220.04a4.190.01a484.280.06a4.290.05a3.970.03a3.960.05a724.150.02a4.150.02a3.860.01a3.870.02a1203.950.01a3.940.06a3.900.04a3.860.04aT1液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵T2液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵項目培養(yǎng)時間（h）注：同一溫度下同列標注字母不同者差異顯著（P0.05）。 下表同。楊雪海等：飼料發(fā)酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數(shù)量變化的影響試 驗 研 究31從圖 1 可見，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵在 T1、T2 兩個發(fā)酵溫度下隨發(fā)酵時間的延續(xù)均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在 120 h 時降到最低，隨后出現(xiàn)輕微的上升。在 24、48、72 h 三個時間點兩種發(fā)酵工藝的pH 值T2 明顯低于 T1（P0.05），在隨后的時間未表現(xiàn)出明顯的差異(P0.05)。2.2 發(fā)酵過程中植物乳桿菌菌數(shù)變化2.2.1 不同發(fā)酵工藝對植物乳桿菌菌數(shù)的影響（見表 4）從表 4 可知，發(fā)酵溫度為 20 （T1）時，48 h 以前2 種發(fā)酵工藝的植物乳桿菌菌數(shù)差異顯著 （P0.05），72 h 以后的各點差異不顯著；而發(fā)酵溫度為 30 （T2）時，24 h 以前 2 種發(fā)酵工藝的植物乳桿菌菌數(shù)差異顯著（P0.05），24 h 以后的各點差異不顯著。2.2.2 不同發(fā)酵溫度對植物乳桿菌菌數(shù)的影響（見圖 2）121086420菌數(shù)(logcfu/g)0 2448 72 120168液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T1液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T2固態(tài)發(fā)酵 T1固態(tài)發(fā)酵 T2時間（h）圖 2 不同發(fā)酵溫度對植物乳桿菌菌數(shù)的影響從圖 2 可知，在 72 h 以內(nèi)，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵植物乳桿菌數(shù)菌數(shù)在 T1、T2 發(fā)酵溫度下未表現(xiàn)明顯差異(P0.05)。但在隨后的發(fā)酵時間里，表現(xiàn)出顯著的差異（P0.05）。T1 發(fā)酵溫度下的植物乳桿菌菌數(shù)優(yōu)于 T2 發(fā)酵溫度。2.3 發(fā)酵過程中 E.colik88 的菌數(shù)變化2.3.1 不同發(fā)酵工藝對 E.colik88 菌數(shù)的影響（見表 5）由表 5 可見，在 T1 發(fā)酵溫度下，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝和固態(tài)發(fā)酵工藝大腸桿菌 E.colik88 菌數(shù)表現(xiàn)出較大的差異。液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵大腸桿菌 E.colik88 呈直線下降趨勢，在 72 h 降到檢測限以下，固態(tài)發(fā)酵則表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，固態(tài)發(fā)酵在 120 h 才降為檢測限以下。在 T2 發(fā)酵溫度下，2 種發(fā)酵工藝大腸桿菌 E.colik88 菌數(shù)在發(fā)酵 24 h 時差異顯著（P0.05)，隨后均降為檢測限以下。2.3.2 不同發(fā)酵溫度對 E.colik88 菌數(shù)的影響（見圖3）從圖 3 可見，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵大腸桿菌 E.colik88 的菌數(shù)在 T1、T2 發(fā)酵溫度下，呈直線下降趨勢，在 T1 溫度下 72 h 降到檢測限以下，而在 T2 溫度下48 h 就降到了檢測限以下。固態(tài)發(fā)酵 E.colik88 菌數(shù)則表現(xiàn)為先上升后下降，在 T1 溫度下，48 h 達到最高值，隨后出現(xiàn)下降，120 h 降到檢測限以下，在 T2 溫度1689.590.17a9.540.20a8.910.12a8.930.09a表 4 不同發(fā)酵處理對植物乳桿菌菌數(shù)的影響（logcfu/g）08.200.20a6.150.15b8.200.20a6.150.15b249.530.10a9.410.11b9.630.23a9.490.14b489.620.08a9.470.09b9.590.09a9.570.21a729.630.23a9.540.14a9.600.18a9.530.05a1209.560.14a9.560.17a8.860.08a8.930.13aT1固態(tài)發(fā)酵液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵T2固態(tài)發(fā)酵液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵項目培養(yǎng)時間（h）1683.00.003.00.003.00.003.00.00表 5 不同發(fā)酵工藝對 E.colik88 菌數(shù)的影響（logcfu/g）06.000.12a6.000.12a6.000.12a6.000.12a245.960.15a7.000.05b4.400.20a6.850.15b485.100.08a8.300.15b3.00.003.00.00723.00.005.450.08a3.00.003.00.001203.00.003.00.003.00.003.00.00T1液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵T2液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵項目培養(yǎng)時間（h）注：“”表示當(dāng)微生物的數(shù)目低于檢測限時，該微生物數(shù)目用檢測限表示。 大腸桿菌的檢測限為 3.0 logcfu/g。 數(shù)據(jù)以“平均值標準差”的形式表示。楊雪海等：飼料發(fā)酵工藝對益生菌增殖及大腸桿菌數(shù)量變化的影響試 驗 研 究32下，24 h 升到最高值，隨后降為檢測限以下。0 2448 72 1201689876543210E.colik88菌數(shù)(logcfu/g)液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T1液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵 T2固態(tài)發(fā)酵 T1固態(tài)發(fā)酵 T2時間（h）圖3 不同發(fā)酵溫度對 E.colik88 菌數(shù)的影響3 討論有些發(fā)酵飼料的加工并不是人為接種微生物，這種發(fā)酵叫做自然發(fā)酵。目前國外大多數(shù)液態(tài)發(fā)酵飼料采用這種發(fā)酵方式。但是自然發(fā)酵的方向不容易控制，結(jié)果可預(yù)見性比較差。微生物接種發(fā)酵做為一種新型的發(fā)酵方式，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，可以產(chǎn)生預(yù)見性更強的發(fā)酵結(jié)果。因此本試驗比較了在不同的發(fā)酵溫度下，微生物接種后進行液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種不同的發(fā)酵工藝對發(fā)酵過程中的 pH 值、乳酸菌菌數(shù)及 E.colik88 菌數(shù)的影響。3.1 酸化日糧能改善動物消化機能研究表明，只有動物消化道 pH 值穩(wěn)定在適合的范圍內(nèi)，才能維持正常的消化生理，pH 值過高能顯著地抑制胃蛋白原的活化，當(dāng) pH 值高于 6 時，胃蛋白就會失活。發(fā)酵飼料較低的 pH 值滿足動物的這種需要。試驗中液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵均能在 24 h 內(nèi)使pH 值降到 4.5 以下，隨著發(fā)酵溫度的升高降低的幅度更大，并且相同時間內(nèi) 30 的發(fā)酵溫度 pH 值要低于20 的。在固態(tài)發(fā)酵過程中，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵起始 pH值優(yōu)于直接固態(tài)發(fā)酵（P0.05），主要是因為在液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝中，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸在轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵時具有明顯的酸化日糧的作用。3.2 發(fā)酵影響乳酸菌數(shù)乳酸菌由于其具有降低消化道內(nèi) pH 值、抑制其它病原性微生物生長、保持或恢復(fù)腸道內(nèi)微生物群落的平衡、防病促生長等作用，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健、飼料發(fā)酵及畜禽疾病防治等方面。有資料報道，益生菌發(fā)揮功能的最低劑量為 6 logcfu/g，因此，其數(shù)量就成為各種產(chǎn)品追求的主要指標。本次試驗中，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵乳酸菌數(shù)均達到了9.5 logcfu/g 左右，這與 Van Winsen(2002)、Demeckova(2006)等所報道的乳酸細菌數(shù) 9.4 logcfu/g 相一致。在固態(tài)發(fā)酵的初始階段，液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝乳酸菌數(shù)優(yōu)于直接固態(tài)發(fā)酵（P0.05），隨后無明顯差異 (P0.05)。這是因為在液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵工藝中液態(tài)發(fā)酵過程使乳酸菌得到大量的增值，所以在轉(zhuǎn)固時較直接固態(tài)發(fā)酵乳酸菌數(shù)占明顯優(yōu)勢，隨著發(fā)酵的過程進行乳酸細菌數(shù)趨向一致。3.3 發(fā)酵過程中不同菌增殖特點飼料和水接觸后，發(fā)酵即開始。在發(fā)酵的起始階段，發(fā)酵飼料以低的乳酸菌含量、高的 pH 值和大腸桿菌的增值為特點。隨后發(fā)酵將進入一個穩(wěn)定階段，以高的乳酸菌和低的大腸桿菌含量為特點。試驗中固態(tài)發(fā)酵大腸桿菌 E.colik88 出現(xiàn)先增殖后下降的趨勢，這與 Jensen（1998）、Canibe（2003）報道的相一致。而液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵指示菌株 E.colik88 成直線下降趨勢，對 E.colik88 有明顯的抑制作用。這可能是在液態(tài)發(fā)酵過程中，接種的