潘景軒-合肥腫瘤-腫瘤干細胞會議

潘景軒 中山大學,2015.11.27,酪氨酸激酶抑制劑Imatinib耐藥克服策略研究,腫瘤治療,傳統(tǒng)藥物：選擇性差, 毒副作用大靶向藥物：選擇性好, 毒副作用小,分子靶向治療,引起腫瘤發(fā)生的起始原因和繼續(xù)牽引力量腫瘤細胞高表達;正常細胞不/低表達,基因修補/干預單克隆抗體小分子化合物: 可控,可穿透胞膜,作用快,排謝快。 Gleevec (STI571, 格列衛(wèi)),靶點:,攻擊手段:,慢性粒細胞性白血病(CML),1960，Peter Nowell 和David Hungerford CML “費城染色體”，見于-95%CML。1973，染色體易位t(9,22)。,Janet Rowley,1985, CML病人，Bcr-Abl cDNA,Bcr-Abl酪氨酸激酶,Ras,Raf,MEK,Erk,AKT,PI3K,mTOR,Stat3,Stat5,Regulation of gene transcription(Mcl-1, Bcl-XL, cyclin D1),Nucleus,Cytoplasmic,Bcr-Abl,Cell proliferation, Survival, Oncogenesis,Membrane,Bcr-Abl CML治療的靶點,Bcr-Abl是引起CML的起始原因(1990)：,CML細胞生長是否繼續(xù)依賴 Bcr-Abl？,人的Bcr-Abl cDNA轉染正常骨髓細胞，回輸給正常小鼠，發(fā)生類CML 轉Bcr-Abl基因小鼠發(fā)生類CML,Brian Druker,1995年12月ASH年會，Brian Druker做了報道。,1993，發(fā)現其中一個小分子化合物 STI571 (Signal Transduction Inhibition)在體外選擇性地殺死 90%的CML細胞而不殺傷正常細胞。,STI571小分子化合物的發(fā)現,1990，Ciba-Geigy制藥公司Alex Matter等研制小分子化合物抑制PKC。,How Does STI571 Work?,Kinase: Bcr-Abl,STI571,1996年，狗, 對肝有毒1997年，合適的劑量, 猴子,對肝無毒。 1997年，Peter Graf研究出了STI571的口服制劑 配方，取代靜脈注射法。,STI571小分子化合物的發(fā)現,I期臨床試驗,1998年6月，Druker，Charles Sawyers及Moshe Talpaz等人共同執(zhí)導I期臨床試驗。 CML病人入組的標準：干擾素治療（傳統(tǒng)治療）失敗，不適合骨髓移植，處于慢性期。Gleevec (STI571)，25 mg/d起，每月增加劑量。200-300 mg/d，CML外周血白細胞下降，5個月后，病人骨髓Bcr-Abl陽性細胞減少到檢測不出的水平 。至1999年夏共招募了149例CML，90%有效。,Gleevec,Gleevec was FDA-approved as first-line therapy for CML,Gleevec, imatinib mesylate, STI571,酪氨酸激酶抑制劑Gleevec: 成就,Its a milestone because Gleevec is the first small-molecule drug that works by targeting the specific biochemical defect that causes the cancer.,2001年世界十大科技突破之一Breakthrough Of The Year, Dec 2001,Gleevec (STI571, 格列衛(wèi))靶點: Bcr-Abl c-KIT PDGFR 里程碑 新紀元慢粒白血病等臨床一線用藥臨床治療: 95%有效,Gleevec獲得性耐受重大挑戰(zhàn),14,靶基因突變,靶基因擴增,靶基因非依賴性腫瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子構象改變,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表達,Gleevec耐受,新化合物,腫瘤干細胞,15,2nd-generation TKIs are not effective against Gleevec-resistance due to “gate-keeper”point mutations,Dasatinib,Nilotinib,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,T315I D816V T674I,根據激酶活性中心計算機輔助合理藥物設計,化合物文庫,計算機模擬篩選,合成,小分子化合物來源,生物學活性檢測與藥效學研究,先導化合物,靶基因突變,靶基因擴增,靶基因非依賴性腫瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子構象改變,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表達,Gleevec耐藥,新化合物,T315I D816V T674I,EXEL-0862: 克服Gleevec耐受的新化合物發(fā)現：能結合并抑制D816V c-KIT和T674I PDGFR 殺傷攜帶有突變體酪氨酸激酶的腫瘤細胞意義：為相關白血病患者治療提供一種可能的新藥研制新結構的化合物克服Gleevec耐受的策略可行第一作者:Blood 2007Leukemia 2007,18,18,基于酪氨酸激酶的結構，利用計算機輔助藥物設計、合成了結構全新的噻唑胺類化合物和芳基炔類化合物（目前已累計1000余種）,19,19,能克服Gleevec耐藥的新結構化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,GZD824抑制T315I Bcr-Abl,GZD824, S116836,J Med Chem 2013,性狀：白色或微黃色粉末狀晶體熔 點：158-160 C分子量：532.56 （724.77，甲磺酸鹽）中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01010216603.7 ；200910193571.0 PCT申請：2011最大吸收波長：285nm3nm,GDZ824,IC50 (nM),與丁克教授合作,T315I Bcr-Abl CML,21,21,能克服Gleevec耐藥的新結構化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,22,S116836抑制PDGFR及其下游信號通路,A,B,23,23,S116836抑制PDGFR突變體耐藥細胞的增殖,細胞活力,克隆形成能力,24,24,S116836誘導PDGFR突變體耐藥細胞的凋亡,B,25,25,S116836的藥物代謝動力學研究,S116836大鼠的生物利用度為35.3%。,26,26,S116836誘導凋亡的關鍵蛋白-BH3-only蛋白Bim,A,B,27,27,S116836誘導Bim上調的機制,C,D,E,28,28,S116836的體內抗腫瘤作用,通訊作者: Oncotarget. 2014,29,29,能克服Gleevec耐藥的新結構化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,30,126332能克服D816V KIT引起的Gleevec耐藥,A,B,C,D,通訊作者：Cancer Lett. 2014.,根據激酶活性中心計算機輔助合理藥物設計,化合物文庫,計算機模擬篩選,合成,小分子化合物來源,生物學活性檢測與藥效學研究,先導化合物,Structure of triptolide,Tripterygium wilfordii Hook. f.,靶基因突變,靶基因擴增,靶基因非依賴性腫瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子構象改變,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表達,Gleevec耐受,T315I D816V T674I,翻譯后,轉 錄,翻 譯,抑制劑,意義：,為相關腫瘤的治療提供了一種可能的新途徑提示通過抑制基因轉錄克服Gleevec耐受是有效的策略,通訊作者:Cancer Sci. 2009Cancer Sci. 2009Cancer Lett. 2010,D816V C-KIT胃腸間質瘤T674I PDGFR高嗜酸白血病V617F JAK2 骨髓增殖病(MPD),克服Gleevec耐受: 抑制轉錄,發(fā)現：Triptolide殺傷下列點突變體引起的Gleevec耐受,對Triptolide進行了結構改造和優(yōu)化,Celastrol,Tripterygium wilfordii Hook. f.,基因突變,基因擴增,腫瘤干細胞,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子構象改變,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表達,翻譯后,Gleevec耐藥,轉 錄,翻 譯,新化合物,抑制劑,T315I D816V T674I,化療耐受、腫瘤復發(fā)的根源：腫瘤干細胞,腫瘤干細胞的特性：,自我更新增殖和分化潛能靜止狀態(tài),問題：迫切需要尋找能殺傷腫瘤干細胞的藥物。,靶基因突變,靶基因擴增,旁路機制: 靶基因非依賴性腫瘤克隆形成,其他,50%,Bcr-Abl,驅動細胞生長,Y,Z,X,imatinib耐藥機制,腫瘤干細胞,PARP,Actin,Pro-caspase 3,Active Caspase 3,PJ6038 36 h,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,Cyto C,Actin,AIF,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,PJ6038 36 h,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,Survivin,Bcl-2,Bcl-XL,XIAP,Actin,Bim,Mcl-1,小分子探針PJ6038抑制CML耐藥細胞增殖、誘導凋亡,PJ6038 36 h,42,Input biotin biotin-PJ6038,Western blotting,-catenin 是小分子探針PJ6038的結合蛋白,A,B,C,K562,C 0.25 0.5 1.0 M,Actin,Bcr-Abl,D,-catenin,43,NBM,CML,#1 #2 #3 #1 #2 #3,Actin,B,-catenin 在白血病干/祖細胞 (CML CD34+ )中高表達,A,-catenin,CD34+ cells,44,PJ6038誘導CML 干/祖細胞凋亡并增加其對Gleevec的敏感性,A,45,CML #3,0 1.0 0 1.0 0 1.0,Bcr-Abl,-catenin,Actin,CML #1,CML #2,PJ6038, M,CD34+ cells,B,每周半量換液2次，5周后收集細胞，種植在甲基纖維素培養(yǎng)基中,PJ6038降低CML 干/祖細胞的自我更新能力（LTC-IC）,CML BM 標本,80 Gy,用探針處理1周,long-term culture-initiating cell (LTC-IC) medium,2-3周計數克隆數目,Quantitation of LTC-IC using Bulk Cultures,*,*,*,*,*,*,PJ6038降低CML 模型小鼠骨髓中LSK 細胞的比例,骨髓,沉默-catenin誘導 CML 干/祖細胞凋亡,A,B,Control,sh r-catenin #1,sh r-catenin #2,Without Gleevec,With Gleevec,Annexin V-FITC,CD38-PE,48,*,*,*,*,*,*,Control, -catenin shRNA,沉默-catenin 降低CML 模型小鼠骨髓中LSK 細胞的比例,骨髓,Self-renewal,-catenin,leukemia progenitor cells,differentiation,myeloid Leukemia,CML stem cells,PJ6038,Gleevec,Bcr-Abl,HSC,Normal hematopoietic stem cells,LSC,50,第二代TKIs: nilotinib, dasatinib