小鼠在免疫抗原后機(jī)體產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答研究.doc

. 實驗?zāi)康模候炞C小鼠在接受抗原之后機(jī)體產(chǎn)生了特異性免疫反應(yīng)，并觀察小鼠各項生理指標(biāo)以及免疫器官的反應(yīng)狀況，再觀察T細(xì)胞和B細(xì)胞在此應(yīng)答的反應(yīng)狀況。實驗假設(shè)：小鼠免疫滅活疫苗之后，機(jī)體會逐漸產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，一方面T細(xì)胞在接受抗原刺激之后，經(jīng)過陽性和陰性選擇，T細(xì)胞從CD4，CD8雙陽性選擇為單陽性T細(xì)胞，并逐步轉(zhuǎn)移，最終到達(dá)淋巴結(jié)等組織產(chǎn)生效應(yīng)；另一方面，B細(xì)胞也會發(fā)育分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞，相應(yīng)的漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體以應(yīng)對抗原。由于小鼠在接受抗原之后，免疫細(xì)胞在胸腺和脾臟內(nèi)的數(shù)量和種類將發(fā)生變化，另外小鼠血清中也會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。因此假設(shè)，在排出其他偶然因素引起的誤差的情況下，有以下結(jié)果：1. 免疫后的小鼠胸腺大小比對照組更小，脾臟大小比對照組更大；另外免疫后小鼠的淋巴結(jié)比對照組更大。2. 免疫后的小鼠胸腺免疫細(xì)胞數(shù)量小于對照組，脾臟免疫細(xì)胞數(shù)量大于對照組。3. 免疫后小鼠胸腺中的單陽性淋巴細(xì)胞比對照組單陽性淋巴細(xì)胞更多，雙陽性淋巴細(xì)胞比對照組更少；免疫后小鼠的脾臟中單陽性淋巴細(xì)胞數(shù)量多于對照組單陽性淋巴細(xì)胞數(shù)量。4. 免疫后小鼠血清里面的抗體檢測呈陽性，對照組小鼠血清抗體檢測呈陰性。預(yù)期結(jié)果：預(yù)計結(jié)果與假設(shè)一致，即：1. 免疫后的小鼠胸腺大小比對照組更小，脾臟大小比對照組更大；另外免疫后小鼠的淋巴結(jié)比對照組更大。2. 免疫后的小鼠胸腺免疫細(xì)胞數(shù)量小于對照組，脾臟免疫細(xì)胞數(shù)量大于對照組。3. 免疫后小鼠胸腺中的單陽性淋巴細(xì)胞比對照組單陽性淋巴細(xì)胞更多，雙陽性淋巴細(xì)胞比對照組更少；免疫后小鼠的脾臟中單陽性淋巴細(xì)胞數(shù)量多于對照組單陽性淋巴細(xì)胞數(shù)量。4. 免疫后小鼠血清里面的抗體檢測呈陽性，對照組小鼠血清抗體檢測呈陰性。實驗方法：一、小鼠免疫后與對照組的中樞和外周免疫器官的觀察實驗原理： 實驗采取DH5滅活菌液為抗原，對小鼠進(jìn)行注射，小鼠在接受抗原之后，機(jī)體會對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，然而抗原在體內(nèi)具有一定的半衰期，重復(fù)注射可以提高機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。當(dāng)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答之后，機(jī)體的中樞和外周免疫器官大小會發(fā)生變化，即表明小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答程度。實驗材料：1. BALB/c小鼠：6-10周齡，雄鼠，清潔級，上海斯萊克實驗動物有限公司 2. DH5滅活菌液（2109個/ml）：制備方法：將DH5擴(kuò)增至飽和，取出3500rpm離心15min，棄上清，用生理鹽水重懸計數(shù)，121，20min滅活，計數(shù)并稀釋。（3次接種，每次500ul） 3. 工具：1ml注射器（針頭），酒精棉球，眼科剪，眼科鑷，眼科彎鑷，廢物筒，解剖板，離心管（離心管架），小鼠尸體袋。 4. 試劑：生理鹽水（3次接種，每次500ul）實驗方法：第一次抗原免疫小鼠 1. 做好準(zhǔn)備工作，注射器內(nèi)裝入1ml DH5滅活菌液和生理鹽水 2. 腹腔注射： 小心抓起小鼠，使小鼠腹部朝上，用酒精棉球擦一擦，向小鼠的中線略左的位置，先挑其表皮，再斜向下插入0.5-1cm的距離，注射后拔出，用剪刀剪去耳朵做好標(biāo)記。 3. 鼠籠做好標(biāo)記，等待一周后，再第二次免疫小鼠。第二次免疫小鼠 大約一周后，根據(jù)做好的標(biāo)記，用相同的方法進(jìn)行免疫，再放回鼠籠，等待一周。第三次免疫小鼠 大約一周后，根據(jù)做好的標(biāo)記，用相同的方法進(jìn)行免疫，再放回鼠籠，等待一周。取小鼠血清，脾臟，胸腺及腹股溝淋巴結(jié)a. 小鼠的眼部取血 1. 離心管，離心管架準(zhǔn)備，套上保鮮膜，并做好標(biāo)記。 2. 對應(yīng)標(biāo)記的取血：小心抓起小鼠，暴露其眼球，小心剪去眼球以及相應(yīng)血管，并輕輕撫摸小鼠胸部，盡量收集血液。 3. 等小鼠不再流血后，脫臼法處死小鼠，血液靜置一小時，并編號。b. 脾臟，胸腺及腹股溝淋巴結(jié)的摘取 1. 取處死的小鼠，腹部朝上，使腹腔伸展，并固定四肢。 2. 解剖剪去上皮，小心將上皮撕開，在腹股溝約三叉血管交叉處尋找類似球形實心組織，即為淋巴結(jié)。 3. 小心剪開腹部，在小鼠右側(cè)腸道位置找到脾臟并取出。 4. 小心剪開胸骨，在心臟上部找到兩瓣白色的器官，即為胸腺。c. 血清分離 1. 靜置的血清，離心5min，3000rpm 2. 小心取上清液，編號，若為淡黃色，即可收集保存，否則重復(fù)第一步。 3. 冷藏血清，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。數(shù)據(jù)獲取及處理：獲得免疫組和對照組的免疫器官之后，將其置于一張紙上對比拍照，并通過照片觀察可得到相應(yīng)結(jié)論。二、小鼠免疫后淋巴器官中淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的變化實驗原理： 利用200目鋼絲篩網(wǎng)，研磨胸腺和脾臟并過濾掉結(jié)締組織，即可獲得淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的混合物，通過紅細(xì)胞裂解液的作用使紅細(xì)胞裂解，即可獲得純的淋巴細(xì)胞，通過血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)，即可反應(yīng)各個淋巴器官的淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化。實驗材料：1. BALB/c小鼠：6-10周齡，雄鼠，清潔級，上海斯萊克實驗動物有限公司 2. DH5滅活菌液（2109個/ml）：制備方法：將DH5擴(kuò)增至飽和，取出3500rpm離心15min，棄上清，用生理鹽水重懸計數(shù)，121，20min滅活，計數(shù)并稀釋。（1次接種， 500ul）3. 工具：1ml注射器（針頭），酒精棉球，眼科剪，眼科鑷，眼科彎鑷，廢物筒，解剖板，離心管（離心管架），小鼠尸體袋，細(xì)胞計數(shù)板（載玻片），顯微鏡，擦鏡紙，天平，離心機(jī)，200目篩網(wǎng)。4. 試劑：生理鹽水（1次接種，500ul）,75%酒精，1PBS，RBC裂解液，3%冰醋酸。實驗步驟：小鼠免疫：本實驗需要免疫一次的小鼠，實驗方法與三次免疫小鼠的第一次相同。眼球取血：方法同前面的取血方法相同。小鼠的脾臟和胸腺的淋巴細(xì)胞分離 1. 摘取小鼠的脾臟和胸腺，置于兩份PBS溶液中，做好標(biāo)記。（方法與脾臟和胸腺的觀察的摘取方法相同）。 2. 用200目篩網(wǎng)研磨過濾，并轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，編號。 3. 2500rpm，10min離心（天平配平）。 4. 棄上清，對脾臟細(xì)胞加入1mlRBC裂解液重懸裂解，5min；對胸腺細(xì)胞加入1mlPBS，待用。 5. 脾臟溶液加1PBS終止裂解，配平，4離心2000rpm，10min。 6. 向脾臟細(xì)胞加入1mlPBS重懸，將脾臟細(xì)胞和胸腺細(xì)胞懸液混勻，各取10ul，編號。 7. 加入等體積的冰醋酸，PBS稀釋，方法如下： 免疫后：脾臟200倍，胸腺10倍 對照組：脾臟100倍，胸腺100倍 8. 細(xì)胞計數(shù) a. 取計數(shù)板和蓋玻片，用酒精洗凈后用擦鏡紙擦干 b. 蓋玻片置于計數(shù)室上部，用槍吸取10ul待測細(xì)胞溶液，加至載玻片邊緣，待其自行滲入。 c. 顯微鏡觀察計數(shù)（1010，100倍） 最后結(jié)果=四個大格子總數(shù)0.25104稀釋倍數(shù)數(shù)據(jù)獲取和處理：通過顯微鏡下觀察計數(shù)板的四個大方格，做到數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，計數(shù)所有細(xì)胞后，最后細(xì)胞的個數(shù)=四個大格子總數(shù)0.25104稀釋倍數(shù)，并記錄下來。三、小鼠免疫后T細(xì)胞的發(fā)育分化的情況觀察實驗原理：免疫標(biāo)記技術(shù)：指用熒光素，放射性同位素，酶，鐵蛋白等作為追蹤物，標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。 本次實驗使用熒光素標(biāo)記后，利用流式細(xì)胞儀，對相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞術(shù)：是一種在液流狀態(tài)下，通過檢測大批量的單個細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，并將其分類的一種技術(shù)。一般通過快速測定熒光，電阻，光散射和光吸收等方法來測定細(xì)胞的各種參數(shù)。 測量樣品要求： 單細(xì)胞懸液，細(xì)胞大小0.2-50um，樣品至少有20000個細(xì)胞，濃度105-107個/ml 流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大??；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強(qiáng)度代表了細(xì)胞表面物質(zhì)的濃度，經(jīng)過光電倍增管將相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)化為電信號，電信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，通過計算器的處理，最后將分析結(jié)果顯示在計算機(jī)上。 抗體選擇：由于需要將CD4，CD8陽性分離，因此標(biāo)記CD4，CD8分子，于是采用： FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8兩種熒光標(biāo)記細(xì)胞。 同型對照：用與檢測特異性無關(guān)的同型同亞型同熒光抗體染色，作為同型對照。實驗材料：Ep管（Ep管架），離心機(jī)，移液器（槍頭），吸水紙，流式管，廢液缸。1PBS，大鼠血清（iso），抗體FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8以及同型對照抗體。FITC-CD4：用量0.3ug/5106個細(xì)胞PerCP-CY5.5-CD8：用量0.3ug/5106個細(xì)胞Iso：FITC-Rat IgG2a：用量0.3ug/5106個細(xì)胞 PerCP-CY5.5- Rat IgG2a：用量0.3ug/5106個細(xì)胞實驗步驟：1. 由細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果，計算出需要從分離的胸腺和脾臟細(xì)胞所取的體積（每管需要1-5106個），取樣與1.5mlEp管中，空白一管，單標(biāo)兩管，同型對照一管，樣品兩管，做好標(biāo)記，并加入PBS補滿1ml。2. 4000rpm離心5min。3. 棄上清，加入75ulPBS重懸細(xì)胞。4. 加入10ul大鼠血清封閉，4避光放置30min。5. 加抗體，按如下方法添加?？瞻證D4單標(biāo)CD8單標(biāo)同型對照對照組免疫組FITC-CD4PerCP-CY5.5-CD8FITC-Rat IgG2aPerCP-CY5.5- Rat IgG2a4避光放置30min。6. 1ml1PBS洗一次，4000rpm，5min離心。7.棄上清，200ulPBS重懸細(xì)胞。8.200目篩網(wǎng)過濾至流式管中，上機(jī)測試。數(shù)據(jù)的獲取和處理：經(jīng)過FACScabibur流式儀的檢測，得到一系列的流式圖，經(jīng)過軟件flowjo7.6的處理，可得一系列的流式結(jié)果，經(jīng)過對照與免疫組的對比，即可得到實驗結(jié)果。四、小鼠免疫后 B細(xì)胞功能的影響實驗原理： 小鼠免疫產(chǎn)生特異性應(yīng)答之后，B細(xì)胞也會發(fā)育分化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。而對于本次實驗，滅活DH5會誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體，因此僅需檢測IgG的作用效果，即可了解B細(xì)胞功能的變化情況?？乖贵w反應(yīng) a. 玻片凝集反應(yīng) 玻片凝集反應(yīng)是指將已知的抗體直接與未知顆粒性抗原物質(zhì)混合，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的情況下，兩者作用出現(xiàn)凝集物即為陽性；無凝集物即為陰性。 b. 試管凝集反應(yīng) 試管凝集反應(yīng)是用已知的顆粒性抗原來檢測抗體及其相對含量，用生理鹽水將待測血清進(jìn)行倍比稀釋，然后加入等量的抗原懸液，經(jīng)過一定時間后，根據(jù)凝集程度可以判斷抗體效價。Elisa法測定IgG含量 Elisa（酶聯(lián)免疫吸附試驗）：將過量的抗體或抗原包被于載體上，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌除去游離抗原后，加入底物成色，定性或定量分析待測物的存在或者含量的檢測方法。 類型：夾心法，間接法，競爭法，捕獲法，ABS-ELISA法 本實驗采取間接法測定IgG含量，待測物為IgG，需要先包被一層抗原后，待被測抗體結(jié)合后，加入含酶標(biāo)的二抗與待測抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌后，通過顯色反應(yīng)，再觀察結(jié)果的方法。實驗材料：抗原抗體反應(yīng)載玻片，marker標(biāo)記，移液槍（槍頭），DH5培養(yǎng)液（4109個/ml），LB培養(yǎng)基，免疫三次和對照小鼠血清，廢液缸，試管16支（試管架），溫箱，生理鹽水。 Elisa法測定IgG含量 酶標(biāo)板（96孔），Ep管（Ep管架），移液槍（槍頭），吸水紙37溫箱 免疫一次，三次及對照血清，PBST（含1吐溫20的PBS），assay液：稀釋液（含0.5%BSA+1吐溫20的PBS），HRP-Goat 抗小鼠IgG：2mg/ml，1:10000倍稀釋，1TMB，2M硫酸實驗步驟：抗原抗體反應(yīng)a.玻片凝集反應(yīng)1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6771. 載玻片按如圖所示處理，編號1-7免疫組對照組2. 向一號孔里加100ul生理鹽水（對照組和實驗組相同）3. 取對照組和實驗組血清20ul，分別加入兩只Ep管中，各加入80ul生理鹽水，混勻，各加10ul到2,3號孔上。（剩余80ul，5倍稀釋）4. 剩余80ul血清加入80ul生理鹽水，混勻，各加10ul到4,5號孔（剩余140ul，10倍稀釋）。5. 140ul血清加入140ul生理鹽水，混勻，各加10ul到6,7號孔（剩余260ul，20倍稀釋）。6. 向兩組的1,2,4,6號加入5ul DH5培養(yǎng)液，3,5,7號加入5ulLB培養(yǎng)基。7. 30min，在顯微鏡下觀察結(jié)果。數(shù)據(jù)的獲取和處理：在顯微鏡下觀察每一個孔，觀察里面是否存在白色絮狀物質(zhì)，若存在，即為陽性，否則為陰性。b.試管凝集反應(yīng)1. 菌液稀釋：需要8000ul菌液，稀釋方法： 240ul菌液+9360ulLB培養(yǎng)基（1108個/ml） 取16支試管，編號，并各加入500ul稀釋后的菌液對照組： 實驗組： 8為對照組，1-7分別為40,80,160,320,640,1280,2560倍稀釋2. 血清稀釋： 取玻片凝集反應(yīng)的20倍稀釋血清，加入260ul生理鹽水（剩余520ul），加500ul到1號試管中，混勻，取500ul再加入到2號試管中，以此類推，知道七號管，取500ul棄置。 3. 向每一只管加500ul稀釋后的菌液，震蕩搖勻，37過夜。4. 過夜后，觀察實驗結(jié)果，是否存在白色絮狀物。數(shù)據(jù)處理：實驗之后的第二天，觀察試管的沉淀情況，以及觀察內(nèi)部白色絮狀物的多少，劃分+等級，+很高陽性，+較高陽性，+為陽性，-為陰性，觀察到結(jié)果后并記錄。Elisa法測定IgG含量1. 抗原準(zhǔn)備 DH5121 20min滅活超聲破碎15min12000rpm離心15min，棄細(xì)胞碎片蛋白定量（400ug/ml）PBS稀釋（1ug/ml）2. 包被，取兩列孔，各加入100ul抗原溶