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一文讀懂 免疫組化步驟、結(jié)果分析及注意事項. 導語實驗室花花師姐正在教導新來的師弟：“想拿高分文章，不學免疫組化怎么行？”免疫組化王子毛博旁邊插話：“是這個理，今天我就豁出去，將我十多年的心得和經(jīng)驗奉獻給小師弟你了。”小師弟感激涕零，唯諾細聽兩位前輩的教誨.免疫組化，免疫組織化學技術(shù)（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應(yīng)，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術(shù)。免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形態(tài)保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復，所以石蠟切片仍然是首選的標本制作方法。 免疫組化步驟詳解 免疫組化結(jié)果分析很多時候，我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結(jié)果。這實在是一件憾事。如下圖，正常的結(jié)果應(yīng)該是這樣的：鏡下細胞核呈藍色，陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色。結(jié)果分析主要有兩種方法，陽性著色細胞計數(shù)法和評分法。前者是在40*光鏡下，隨機10個視野下計數(shù)陽性著色細胞；后者則是在光學顯微鏡下按染色程度（0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐色）和陽性范圍（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）評分，最終分數(shù)相加。免疫組化結(jié)果分析是毛博的特長，以下是他傳授的獨門絕技。1.對照染色和做實驗的時候必須設(shè)立對照組一樣，免疫組化也必須設(shè)立對照染色。沒有對照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的。對照一般有陽性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照。一般來說，有一個陽性組織對照和一個陰性組織對照就足夠了。2.定位抗原表達必須在特定部位。如LCA應(yīng)定位在細胞膜上；CK應(yīng)定位在細胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細胞核內(nèi)等等。不在抗原所在部位的陽性著色，不能視為確切的陽性結(jié)果。有可能是非特異性染色或者假陽性。不能確定怎么辦？這就要用到上一段提到的對照染色了。3.半定位現(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進行定量。如果你的實驗室不幸沒有那么高大上的話，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。因為人為主觀性比較強，所以只能稱作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級：弱（+），中（+），強（+）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（+）=2，強（+）=3。至少隨機觀察5-10個HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（+）% x 2 +（+）% x 3計算出數(shù)值；總數(shù)值1.5者為(+)。4.圖像分析儀如果要進行精確定量的話，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類型很多。這里就不一一介紹了。其實毛博最想隆重推薦的是一款圖像分析軟件：Image J。毛博當年在米國做博士猴的時候，就是用的這款軟件。這是NIH開發(fā)的免費軟件。一般的免疫組化結(jié)果分析用它就綽綽有余了?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)到了1.50版。網(wǎng)上可以免費下載。其界面非常簡潔，如下圖所示?，F(xiàn)在，根據(jù)一個實例來看看如何用Image J來進行圖像分析。如下圖所示，我們有一張細胞的免疫熒光染色的照片。那么，如何用Image J來計數(shù)細胞的個數(shù)呢？首先，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像。步驟如下：ImageType16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后，將要計數(shù)的部分用高亮標示出來。步驟如下：ImageAdjustThreshold。然后拖動鼠標，直到所有的細胞被標示出來。有時候2個細胞靠得比較緊密，會被計數(shù)為1個細胞。這個時候可以采用Image J的水洗功能。步驟如下：ImageBinaryWatershed。如下圖的藍色箭頭所示，這些是本來計數(shù)成一個的細胞，經(jīng)過水洗之后，更加精確地被計數(shù)成了2個細胞。然后，就可以正式開始分析了。步驟如下：AnalyzeAnalyze Particles。在得出最后的結(jié)果之前，還有一些選項需要選擇。如果想要計數(shù)全部的細胞，那么Size項里面選擇“0-infinity”。Circularity的默認值為“0.00-1.00”。一般就取默認值。最后的結(jié)果如下圖所示。軟件自動測量了每個細胞的大小。這里因為是二維圖像，所以就是每個細胞的面積。然后計數(shù)了一共有72個細胞，總面積為21286.00，平均大小為295.64。免疫組化是個苦活，時間長，步驟多，還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì)。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的結(jié)果。以上，毛博介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的實驗狗們都能做出自己想要的結(jié)果，早點發(fā)文章。 非特異性染色的八大原因然而，結(jié)果卻未必都是那么如意的，常常出現(xiàn)下面這種狀況，好好的一張片子染得臟臟的，這就是最常見的非特異性染色。1. 抗體問題，真的是一分錢一分貨?。∫豢褂枚嗫寺】贵w容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結(jié)果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。2. 抗體濃度過高/孵育時間過長一抗?jié)舛忍咭彩浅霈F(xiàn)非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預(yù)實驗。每次使用新抗體前應(yīng)該多做預(yù)實驗，摸索出最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調(diào)好定時器，提醒自己及時終止反應(yīng)，就會避免這個問題。3. DAB染色時間太長/變質(zhì)DAB的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果棒棒噠!4. 內(nèi)源性酶和生物素內(nèi)源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；對于內(nèi)源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25 g/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。5. 組織變干一下子染太多片子的時候，容易出現(xiàn)這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4 mm。6. 浸泡時間過長切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是4C冰箱。只要把容器放在4C冰箱里，過夜完全沒有問題。7. 清洗不充分清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。8. 封閉血清