霍亂弧菌檢驗操作規(guī)程.doc

霍亂弧菌檢驗操作規(guī)程1 范圍本操作規(guī)程規(guī)定了帶菌者糞便，患者糞便、嘔吐物、肛拭子，外環(huán)境水樣，水生動物、食品等標本中的霍亂弧菌的檢驗方法。2 檢驗依據(jù)國家傳染病診斷標準：WS 2892008衛(wèi)生部疾病控制司霍亂防治手冊第五版北京市衛(wèi)生防疫站衛(wèi)生防疫微生物檢驗操作規(guī)程北京市常見傳染病防制工作手冊（北京市疾病預防控制中心傳地所2008年12月內部資料） 3 設備和材料3.1 冰箱： -204。3.2 恒溫培養(yǎng)箱： 361。3.3 暗視野顯微鏡： 10100。3.4 架盤藥物天平： 0g500g, 精確至0.5g。3.5 錐形瓶： 100 mL、500 mL。3.6 滅菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。3.7 滅菌平皿： 直徑90 mm。3.8 滅菌試管：10 mm75 mm、16 mm160 mm.。3.9 滅菌注射器： 1 mL。3.10 載玻片。3.11 蓋玻片。3.12 無菌棉簽。3.13 500mL滅菌采樣瓶。3.14 生物安全柜：級。4 培養(yǎng)基和試劑4.1 堿性蛋白胨水（Ph8.8-9.0 ， 1015mL/管 ， 10 50mL/瓶）。4.2 慶大霉素瓊脂（15-20 mL/塊）。4.3 普通營養(yǎng)瓊脂（15-20 mL/塊）。4.4 半固體培養(yǎng)基（3mL/小管，5mL/中管 ）。4.5 霍亂弧菌單克隆抗體(國家CDC流研所提供， 510L/菌落)。4.6 泰國SA診斷血清（510L/菌落)。5 檢驗程序霍亂弧菌檢驗程序見圖1。6 標本的收集與送檢要求見表標準與要求（一）（四）7 操作步驟7.1 快速輔助診斷：其結果只是初步報告，不是確診報告。7.1.1 動力及動力抑制試驗：7.1.1.1 如是急性期病人的水樣便，則用接種環(huán)或滴管取1滴水樣便在玻片上然后蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動力；或加生理鹽水1滴在玻片上，用接種環(huán)取較干的便1環(huán)放置生理鹽水中研勻，蓋上蓋玻片直接用暗視野顯微鏡觀察動力；高度可疑的標本可取已增菌的堿性蛋白胨水1滴在玻片上然后蓋上蓋玻片，直接用暗視野顯微鏡觀察動力。如在鏡下見到穿梭樣運動（象夜空中的流星）即動力試驗陽性，否則陰性。7.1.1.2 動力試驗陽性的標本，則取O1和O139群霍亂弧菌診斷用單克隆抗體各2滴放置玻片上，取標本1滴或1環(huán)放在其中研勻，蓋上蓋玻片，用暗視野顯微鏡觀察是否有原來的穿梭樣運動，如穿梭樣運動已迅速停止并凝集成塊狀即動力抑制試驗陽性，否則陰性。7.1.1.3 動力試驗和動力抑制試驗結果可口頭初步報告，但不是確診報告。雙陽時口頭報告高度可疑。7.2 分離培養(yǎng)7.2.1 糞便、嘔吐物和肛拭子：對急性期病人水樣便標本在堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)的同時可用接種環(huán)取一滿環(huán)或用棉拭子直接接種在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上；所有病人標本都應接種堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)。37增菌68h后，從菌膜下表層取一接種環(huán)培養(yǎng)物，把接種環(huán)在試管壁上輕輕碰一下，待接種環(huán)上留有殘液后劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，劃線時接種環(huán)在基線處反復多次劃線以接種的菌液干了為準，最后用接種環(huán)從基線處開始不間斷劃線到完成或四區(qū)劃線（必須劃出單個菌落）。37培養(yǎng)，18h-24h。必要時（高度可疑或密接服藥的病人）可取第一次增菌液1 mL轉種于8-10mL堿性胨水管中37二次增菌培養(yǎng)68h后做分離。7.2.2 水樣：十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法 水體的采集一般用無菌的500mL水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內)500mL，23小時內送檢。取450mL水樣，用1mol/L氫氧化鈉調整至pH8.8-9.0。然后加10倍濃縮堿性胨水50mL。為抑制雜菌可再加入1%亞碲酸鉀0.25 mL和1000單位/ mL青霉素1 mL。37培養(yǎng)過夜劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，接種劃線方法同7.2.1。培養(yǎng)時把瓶蓋打開三分之一。培養(yǎng)后取菌膜下表層培養(yǎng)物0.2-0.3 mL接轉種于10mL堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)68h，再劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24h。接種劃線方法同7.2.1。7.2.3 食品及水產(chǎn)品樣本：7.2.3.1 液體食品：同7.2.2 7.2.3.2 涂抹標本：使用無菌棉簽涂抹35只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接種到10 mL堿性蛋白胨水，37增菌培養(yǎng)812h劃線培養(yǎng)。同時取菌膜下表層培養(yǎng)物接種慶大培養(yǎng)基分離培養(yǎng)同時吸0.20.1 mL轉種于10mL堿性胨水管中作二次增菌，37培養(yǎng)812h再劃線接種慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24h。接種劃線方食品及水產(chǎn)品、物品表面涂抹涂樣本表面涂拭物病人糞便標本水樣、液體食品等標本 增菌過夜培養(yǎng)增菌 8-12h增菌 6-8h二次增菌6-8h二次增菌8-12h二次增菌6-8h 動力試驗（+）動力抑制試驗（+）慶大平皿劃線培養(yǎng)18-24h 每皿挑取9-10個可疑菌落血清凝集試驗口頭報告高度可疑 霍亂分群診斷（單克隆抗體）群群 霍亂分型診斷凝集和氧化酶試驗陽性：確診報告PCR（測 CT） 分純（普通瓊脂）18-24h 半固體瓊脂18-24h分純（普通瓊脂） 上送菌種 圖1 法同7.2.1。7.2.3.3 固體食品：25-50克標本放入堿性胨水中增菌培養(yǎng)同7.2.3.2。標本與堿性胨水的比例為1：5。7.3 可疑菌落：每一慶大霉素瓊脂平板上各挑取9-10個少于9個的全部挑取)可疑菌落做玻片凝集試驗進行鑒定?？梢删涞男螒B(tài)：略帶青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑濕潤。如延長培養(yǎng)時間或室溫放置到48h，菌落略帶黃色，中心形成黑色金屬碲沉淀。7.4 鑒定分型7.4.1 玻片凝集試驗7.4.1.1 01、0139群霍亂弧菌初步鑒定：挑取可疑菌落與01群、0139霍亂弧菌單克隆抗體做玻片凝集試驗。如可疑菌落很快(一般在10s內)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集顆粒，在生理鹽水中不凝集者判為陽性。均為陰性時方可報告：未檢出01、0139群霍亂弧菌。7.4.1.2 分純：用接種環(huán)取抗原抗體復合物接種于普通營養(yǎng)瓊脂板上分純，37過夜培養(yǎng)。7.4.1.2 復核及分型：挑取可疑菌落和純培養(yǎng)物進行復核及分型。01、0139群霍亂弧菌用診斷血清和單克隆抗體復核。01群霍亂弧菌分型使用小川型及稻葉型的單價血清和單克隆抗體做玻片凝集反應，同時用生理鹽水做對照。與小川型單價血清和單克隆抗體凝集，與稻葉型單價血清和單克隆抗體不凝集者為小川型。與小川型單價血清和單克隆抗體不凝集，與稻葉型單價血清和單克隆抗體凝集者為稻葉型。與小川型、稻葉型單價血清和單克隆抗體均呈明顯凝集者為彥島型。7.4.2 氧化酶試驗和菌種保存：取純單個菌與相應的血清和單克隆抗體進一步驗證鑒定的結果，如凝集陽性者做氧化酶試驗。氧化酶試驗時應注意不要用過期試劑和金屬鐵質的接種針（環(huán)），操作見WS 2892008附錄A（ A.4.1.2）。氧化酶試驗陽性者保存菌種：用接種環(huán)取單個菌落穿刺半固體培養(yǎng)基中，底部1/3以下不必穿刺。37過夜培養(yǎng)，換膠塞密封室溫保存。7.4.3 PCR檢測霍亂毒素基因，見WS 2892008附錄B。7.4.4 菌種上送：半固體一支；純培養(yǎng)普通瓊脂一塊；填寫統(tǒng)一的送檢單。8 質量控制81 用接種環(huán)取完標本、診斷血清、做完每一份標本實驗等，接種環(huán)應嚴格在酒精燈火焰上消毒，避免交叉污染。82 玻片凝集試驗陽性時，一定同時做生理鹽水對照。在生理鹽水中不凝集者，方可判斷為陽性。83 標本、增菌管、培養(yǎng)平皿要嚴格編號，標識清晰，避免結果錯報。84 診斷血清、培養(yǎng)基保存在指定溫度范圍內；診斷血清要在有效期內使用，培養(yǎng)基保存不超過一個月。9 實驗室生物安全91 標本檢測要穿實驗專用服、戴口罩、手套，用過的口罩、手套放黃色污物袋中，及時高壓處理。92 用過的玻片及時放入消毒缸中浸泡；實驗完畢，用浸泡消毒液的抹布擦拭實驗臺面，或紫外線照射消毒。93 消毒制品要有有效的批準文號，在有效期內使用。 配制的消毒使用液，要表明配制日期。94 標本、培養(yǎng)物、實驗廢棄物等，要經(jīng)高壓消毒處理后，方可丟棄。標準與要求（一）內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求一標本的收集1標本種類患者糞便、嘔吐物、肛拭子必取腸道門診以患者糞便為主；爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子必??；水樣，水生動物、污染的標本以涂抹為主、食品（可疑或剩余）等標本。2標本數(shù)量 水樣便取1-3 mL成形便取指甲大小肛拭子用直腸棉拭或采便管取水樣便或嘔吐物取1-3 mL；成形便取指甲大小；肛拭子用采便管；水樣500mL，涂抹標本以3-5支無菌棉拭涂抹后為一件。食品 液體：250 mL；固體：25-50克標準與要求（二） 內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求二標本的送檢1運送液種類堿性蛋白胨水（增菌液）；文臘二氏保存液；Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基；pH8.89.0堿性蛋白胨水（增菌液）2運送液數(shù)量標本與保存液比例約為1：5pH8.89.0堿性蛋白胨水（增菌液）1015mL標準與要求（三） 內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求三標本的分離培養(yǎng)1 直接分離培養(yǎng)急性期病人水樣便直接接種選擇性培養(yǎng)基腸道門診：急性期病人水樣便直接接種選擇性培養(yǎng)基；動力、制動試驗。爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子直接接種選擇性培養(yǎng)基。2 增菌后分離培養(yǎng)所有標本用堿性蛋白胨水放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基腸道門診非水樣便放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基；動力、制動試驗。爆發(fā)疫情患者糞便、嘔吐物、肛拭子放37增菌68h后接種選擇性培養(yǎng)基；外環(huán)境標本37二次增菌。標準與要求（三） 內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求三標本的分離培養(yǎng)3.分離培養(yǎng)基種類強選擇性培養(yǎng)基：慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂弱選擇性培養(yǎng)基：堿性營養(yǎng)瓊脂強選擇性培養(yǎng)基：慶大霉素瓊脂4. 培養(yǎng)時間和可疑菌落的描述 標本接種分離培養(yǎng)基放37培養(yǎng)1824h可疑菌落：慶大霉素瓊脂和4號瓊脂：灰色、圓形、透明或半透明、光滑、濕潤、扁平、大小約為2mm.堿性營養(yǎng)瓊脂:無色，其余同上灰色、圓形、透明或半透明、光滑、濕潤、扁平、大小約為2mm.標準與要求（四） 內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求四菌株鑒定1.菌株初篩玻片凝集試驗:O1、0139群挑慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和堿性營養(yǎng)瓊脂5個以上可疑菌落氧化酶試驗:腸道門診：玻片凝集試驗O1、0139群挑慶大霉素瓊脂910個可疑菌落標準比較與要求（四） 內 容霍亂診斷標準WS289-20082009年霍亂檢測具體要求四菌株鑒定2. 菌株復篩玻片凝集試驗:氧化酶試驗:區(qū)CDC: 玻片凝集試驗用普通瓊脂的純菌O1、0139群、小川、稻葉氧化酶試驗PCR檢測霍亂毒素基因2.菌株上送按菌株管理要求進行上送半固體一支普通瓊脂一塊立即送檢或電話聯(lián)系根據(jù)情況而定，填寫統(tǒng)一的送檢單北京市腸道傳染病樣本送檢表送檢單位： 送檢日期： 年 月 日標本來源：散發(fā)病例/ 疫情 / 監(jiān)測 / 鑒定 /其他（請注明） 采樣日期： 年 月 日 檢測項目：霍亂弧菌 / 志賀菌 / 腸致瀉性大腸桿菌 / O157：H7 / 沙門菌 / 腹瀉病毒 / 其他（請注明） 編號姓名性別年齡主要癥狀糞便性狀標本類型臨床檢測結果采樣地點檢測結果（所有檢測結果均報）備注糞便可疑陽性培養(yǎng)物其他白細胞紅細胞其他試驗主要癥狀：1發(fā)熱（ ）；2腹瀉（ 次/天）；3腹痛；4惡心；5嘔吐（ 次/天）；6里急后重；7其他（請描述，如呼吸道癥狀）：（可多選）糞便性狀：1稀便，2水樣便，3米泔水樣便，4洗肉水樣便，5粘液便，6膿血便，7血便，8其他（請注明）：檢測腹瀉病毒：需將原始糞便樣本保存在便盒立即送檢。24小時內不能送檢的，凍存在-20冰箱內，運送時加冰運送。送樣人