【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）大豆子葉異黃酮類(lèi)次生代謝物的誘導(dǎo)及其微粒體部分蛋白的初步研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 大豆子葉 異黃酮類(lèi)次生代謝物的誘導(dǎo) 及其微粒體部分蛋白的初步研究 of in of of in of I 摘 要 大豆 L.) 不僅可提供優(yōu)質(zhì)豐富的蛋白質(zhì)和油脂，更是具有多 種生物活性的異黃酮類(lèi)化合物的重要來(lái)源 。 大豆 應(yīng)激反應(yīng)的 主要產(chǎn)物，同時(shí)，它也是一種異戊二烯化的異黃酮，這類(lèi)化合物 生物學(xué)作用 的日顯突出和其分布的局限性吸引著越來(lái)越多研究者的 關(guān)注 。 本研究綜合利用分析高效液相色譜、制備高效液相色譜、同位素標(biāo)記、薄層色譜、四極桿 S/二維電泳等現(xiàn)代 技術(shù)，將分析化學(xué)、制備化學(xué)、蛋白質(zhì)分離純化和 氨基酸序列 測(cè)定充分結(jié)合 ，研究了外源硝酸銀和茉莉酸誘導(dǎo)處理中黃 13 號(hào)和“ ”（荷蘭）大豆子葉后， 其前體 誘導(dǎo)累積規(guī)律及其與其它固有的大豆異黃酮之間的聯(lián)系；同時(shí)，對(duì)大豆中的異戊二烯轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了活性測(cè)定；并對(duì)硝酸銀誘導(dǎo)后大豆子葉微粒體蛋白進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)論如下： 1、 中黃 13 號(hào)與 對(duì) 外來(lái)刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的能力 有所 不同 ， 與 相比，中黃 13 號(hào) 對(duì)外界刺激更為敏感。 2、硝酸銀誘導(dǎo)處理后， 構(gòu)體比例不隨 保溫時(shí)間 的延長(zhǎng)而改變；大豆苷元和染料木素含量上升，其相應(yīng)的糖苷含量下降。茉莉酸 處理后 ， 和 占比例下降， I 所占比例增加 ；同時(shí)，游離苷元含量下降，糖苷含量增加。這表明：雖然硝酸銀和茉莉酸都能夠誘導(dǎo)大豆子葉中 累積，但是，其作用機(jī)制有可能不同。 硝酸銀 誘導(dǎo) 積的能力最強(qiáng)，其次依次為 和 硝酸銀。10 導(dǎo) 積的能力最強(qiáng)， 20 M100 M 的茉莉酸誘導(dǎo) 積的能力相近 ， 1 濃度 的茉莉酸非 但 未 能 增強(qiáng) 誘導(dǎo) 積的 能力 ，反而 有可能 在某種程度上抑制了 累積 。 3、在 積過(guò)程中，苯丙氨酸代謝途徑中的相關(guān)化合物在發(fā)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的同時(shí)，還發(fā)生著空間上的轉(zhuǎn)移。植物抗毒素 累積只發(fā)生在遭遇刺激的部位 ；同時(shí)，該部位中與之有關(guān)的其它異黃酮濃度也高于健康部位。另外，這些化合物還存在著從健康部位向遭遇刺激部位轉(zhuǎn)移的傾向，且與遭遇刺激部位垂直相連的部位有可能比與之橫向相連的部位更容易與受刺激部位發(fā)生異 黃酮間的轉(zhuǎn)運(yùn)和交換。 4、利用制備高效液相色譜， 從 390g（ 鮮重 ） 硝酸銀 誘導(dǎo) 的大豆子葉中 分離 純化出 約110純度的 282 g/g 鮮重 ） ， 為大豆中 異戊二烯 轉(zhuǎn)移酶的研究提供了 難得 的底物 ，并 提供了一種 分離純化 有 效方法 。 5、利用 3H 底物進(jìn)行大豆中異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定。用同位素標(biāo)記與薄層色譜相結(jié)合，檢驗(yàn)并分離、制備反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng) S 分析鑒定，反應(yīng)產(chǎn)物為 中對(duì) 以大量 累積的問(wèn)題進(jìn)行了初步分析。大豆中異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活性的成功測(cè)定為該酶的進(jìn)一步研究提供了可靠保證，同時(shí)也有利于其它與之相關(guān)的微粒體蛋白的研究。 6、對(duì)二維電泳技術(shù)用于硝酸銀誘導(dǎo)后大豆子葉微粒體膜蛋白分離的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：在重新水化溶液組成中，還原劑比去垢劑對(duì)膜蛋白溶解性的影響更大，還原劑三丁基膦比二硫蘇糖醇效果好，去垢劑 (3-(4對(duì) 蛋 白 質(zhì) 的 增 溶 作 用 強(qiáng) 于 和 -(31由硫脲、尿素、去垢劑還原劑三丁基膦構(gòu)成的重新水化溶液（ 較適合大豆子葉微粒體膜蛋白的溶解。本研究的最佳操作條件確定為： 重新水化溶液，加樣量為 80g，等電聚焦 20,000（適用于 703條）。 7、二維電泳結(jié)果表明：總體來(lái)看，對(duì)照樣品中蛋白量 總量多于誘導(dǎo)樣品，大部分大豆子葉微粒體蛋白的等電點(diǎn)位于 ?？偣舶l(fā)現(xiàn) 14 個(gè)由硝酸銀誘導(dǎo)而產(chǎn)生的點(diǎn)，其中，在 范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn) 4 個(gè)，在 范圍內(nèi)有 10 個(gè)。在 0 范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)只存在于誘導(dǎo)樣品而不存在于對(duì)照樣品的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 8、四極桿 S/定和氨基酸序列分析表明：硝酸銀處理可以誘導(dǎo)大豆 蛋白酶抑制劑（ 其 5亞基和誘導(dǎo)蛋白“ 產(chǎn)生。 本 研究結(jié)果對(duì)于 調(diào)控 大豆中 異戊二烯 化 黃酮 類(lèi)化合物的 合成 、深入了解 大 豆 “代謝網(wǎng)”、 探討激發(fā)子的作用機(jī)理、 研究微粒體誘導(dǎo)蛋白、實(shí)施大豆 次生代謝 物 調(diào)控和性狀的定向改變 等工作具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義，必將推動(dòng)這些工作的順利進(jìn)行，從而有助于 利用分子生物學(xué)和基因工程手段改善 和提高 大豆的有益性狀 ， 使大豆 能夠 為人類(lèi)提供更多的健康植物化合物(最終將在更大程度上有助于大豆各方面價(jià)值的 大幅度 提升。 關(guān)鍵詞：大豆，子葉，硝酸銀，茉莉酸，誘導(dǎo)， 豆異黃酮 L.) us is an of a of As of in is of In we as S/MS D to of by o. 13 . At of in a on of as 1. to . 2. In as of t of of In of II of I in At of of It to of 0 M to be to of 3. of in to of in of of to of in is of is a to to of in to in 4. It in At it an of 5. 3H as in of LC as S/ . of D In 3-(4to of as 7. D of of in to be 6. 6 (4 8 (10 in no in 10. 8. S/MS of V 目 錄 第一章 引言 . 1 豆中的黃酮類(lèi)化合物 . 1 酮類(lèi)化合物的基本結(jié)構(gòu)和分類(lèi) . 1 酮類(lèi)化合物 在植物類(lèi)群中 的分布 . 1 黃酮類(lèi)化合物 . 1 戊二烯化黃酮類(lèi)化合物 . 7 豆中的異戊二烯化異黃酮 . 9 發(fā)現(xiàn)及其基本性質(zhì) . 9 生物學(xué)作用 . 11 生物合成 . 11 誘導(dǎo)與累積 . 13 豆中的異戊二烯轉(zhuǎn)移酶 . 25 戊二烯轉(zhuǎn)移酶 . 25 物合成中的其它酶的研究進(jìn)展概述 . 30 白質(zhì)分離中的二維電泳技術(shù) . 31 維電泳技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 . 31 維電泳技術(shù)分離膜蛋白 . 32 響二維電泳效果的其它因素 . 34 維電泳技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展 . 35 研究的目的和意義 . 36 第二章 大豆中 誘導(dǎo) . 38 料與方法 . 38 驗(yàn)材料 . 38 驗(yàn)方法 . 38 果與分析 . 40 發(fā)子濃度對(duì) 其它大豆異黃酮的影響 . 40 酸 銀和茉莉酸誘導(dǎo)處理后 其它大豆異黃酮在子葉中的分布 . 49 論與結(jié)論 . 51 發(fā)子對(duì) 積的誘導(dǎo) . 51 同品種的大豆產(chǎn)生 情況不同 . 52 豆 代謝網(wǎng) . 53 論 . 54 第三章 制備 . 55 料與方法 . 55 驗(yàn)材料 . 55 試驗(yàn)方法 . 57 果與分析 . 57 備高效液相色譜流動(dòng)相的選擇 . 57 分離純化 . 58 鑒定 . 59 論與結(jié)論 . 61 第四章 異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定 . 62 料與方法 . 62 驗(yàn)材料 . 62 驗(yàn)方法 . 62 果與分析 . 64 豆子葉中的異戊二烯化反應(yīng) . 64 豆子葉異戊二烯轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)產(chǎn)物的制備和鑒定 . 66 于 積的探討 . 68 論 . 68 第五章 硝酸銀誘導(dǎo)的大豆子葉微粒體蛋白初步研究 . 69 料與方法 . 69 驗(yàn)材料 . 69 驗(yàn)方法 . 70 果與分析 . 72 響大豆子葉微粒體蛋白溶解和 2. 72 酸銀誘導(dǎo)的大豆子葉微粒體部分蛋白的 初步 分析 . 76 論與結(jié)論 . 80 第六章 結(jié)論 . 81 參考文獻(xiàn) . 85 致謝 . 109 作者簡(jiǎn)歷 . 110 格 目 錄 表 1見(jiàn)豆科植物中異黃酮含量 . 1豆中主要常見(jiàn)異黃酮 . 1豆中固有的常見(jiàn)異黃酮 糖苷含量 . 1要 大豆 異黃酮生物活性 . 1要異戊二烯化黃酮類(lèi)化合物 . 1要異戊二烯化黃酮類(lèi)化合物的植物學(xué)分布 . 1. 1豆器官、抗病性以及生長(zhǎng)時(shí)光照對(duì) 積的影響 . 2試所采用的 作系統(tǒng) . 2 ”和中黃 13 號(hào)固有大豆異黃酮含量及分布概況 . 2和硝酸銀處理后“ ”和中黃 13 號(hào)大豆子葉中異黃酮變化情況 (%). 2莉酸誘導(dǎo)后中黃 13 號(hào)大豆子葉中異黃酮分布情況 (%). 2酸銀 和 茉莉酸 誘導(dǎo)后 染料木素 在子葉各部 位 的分布和變化 . 3備高效液相色譜 及對(duì)應(yīng)的 分析高效液相色譜 結(jié)果 . 4開(kāi)后各部分 3H放射活性 (. 5同去垢劑組成的重新水化溶液 . 503. 5酸銀誘導(dǎo)的大豆子葉微粒體部分經(jīng)過(guò)二維電泳后獲得的某些點(diǎn)的等電點(diǎn) 和分子量 . 5部分蛋白質(zhì)與測(cè)定樣品匹配情況 . 目 錄 圖 1酮類(lèi)化合物的基本結(jié)構(gòu) 及其 分類(lèi) . 1酮類(lèi)化合物的生物合成 . 1豆中主要異黃酮結(jié)構(gòu)式 . 1豆中誘導(dǎo)產(chǎn)生的次生代謝物 . 1生物合成途徑 . 1豆中來(lái)自前體苯丙氨酸的與防御系統(tǒng)有關(guān)的化合物的合成路徑 . 2和中黃 13 號(hào)大豆子葉的 譜 . 42 圖 2酸銀濃度對(duì) 和中黃 13 號(hào)中 積的影響 . 43 圖 2酸銀濃度和處理后保溫時(shí)間對(duì) 中 構(gòu)體比例的影響 . 44 圖 2酸銀濃度和處理后保溫時(shí)間對(duì)中黃 13 號(hào)中 構(gòu)體比例的影響 . 2莉酸濃度和處理后保溫時(shí)間對(duì)中黃 13 號(hào)中 構(gòu)體比例的影響 . 3制備過(guò)程 . 3動(dòng)相組成對(duì) 大豆甙流出順序的影響 . 3備樣品與 質(zhì)譜圖譜比較 . 4的點(diǎn)樣和區(qū)域劃分 . 4物合成的最后步驟及異戊 二 烯轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng) . 65 圖 4樣品 譜 . 5照樣品和硝酸銀誘導(dǎo)樣品使用不同 度膠條的二維電泳圖像 . 寫(xiě) 表 分析用高壓液相色譜 ) 7 (3-(4 3-(31 界膠束濃度） 3,9 3,9 2 焦磷酸 2 1 法尼焦磷酸 ) 法尼焦磷酸合成酶 ) 牛兒 牻牛兒焦磷酸 ) 牻牛兒焦磷酸合成酶 ) 磷酸類(lèi)異戊二烯合成酶 ) f. (大雄疫霉大豆專(zhuān)化型 ) 制備高效液相色譜 ) f. 大雄疫霉細(xì)胞壁提取的 多糖誘導(dǎo)子 ) 十二烷基硫酸鈉 ） (61,6a,9 一異戊二烯焦磷酸合成酶）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 豆中的 黃酮 類(lèi) 化合物 酮類(lèi)化合物的基本結(jié)構(gòu)和分類(lèi) 黃酮 類(lèi) 化合物 （ 指兩個(gè)芳香環(huán) （ 通過(guò) 中央三碳原子 連接成的 具有架結(jié)構(gòu) 的 一系列化合物，其基本結(jié)構(gòu)可簡(jiǎn)單描述為 1 常連 接有酚羥基、甲氧基、甲基、 異戊二烯 基等官能團(tuán) 或 與糖結(jié)合成苷 （程水源 ， 等， 2000；姚新生， 2003； et 1998） 。 該 系列中的 第一個(gè)化合物查爾酮（ (圖 1 進(jìn)一步衍生轉(zhuǎn)化構(gòu)成 各類(lèi)黃酮 類(lèi) 化合物 （圖 1。根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、 2、 3 或 4 位 ）以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點(diǎn) (少數(shù)情況下，六元雜環(huán) C 發(fā)生異構(gòu)形成開(kāi)環(huán)或被五元環(huán)代替，圖 1，可將主要的天然黃酮 類(lèi) 化合物分為 6 類(lèi)：查爾酮 (黃酮 (黃酮醇 (黃烷酮 (花青苷 ( 異黃酮 類(lèi)化合物 （ 圖 1），其中雜環(huán)C 的氧化狀態(tài)和 B 環(huán)的位置在分類(lèi)中至關(guān)重要（ ）。 酮 類(lèi) 化合物 在植物類(lèi)群中 的分布 黃酮 類(lèi) 化合物與類(lèi)異戊二烯和生物堿一起構(gòu)成高等植物次生代謝的三大類(lèi)主要產(chǎn)物，是植物體內(nèi)多酚類(lèi)的信號(hào)分子及中間體或代謝物，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病和進(jìn) 化過(guò)程中起著重要作用（ 1996）。 它們 廣泛分布于植物界 ， 尤其是高等植物及羊齒類(lèi)植物中，目前結(jié)構(gòu)已經(jīng)鑒定的黃酮 類(lèi) 化合物超過(guò) 8000 多種（ 2000）。查爾酮是其他黃酮 類(lèi) 化合物的直接前體，廣泛存在于多種植物體內(nèi)；黃酮主要存在于草本植物中，如唇形科（ 傘形科（ 菊科（ 及旱芹屬（ 的三羥基黃酮（ 和 木賊屬（ 的木樨草素（ ； 黃酮醇主要存在于被子植物中，如蕓 香（ 蕎麥（ 的櫟醇