藻膽蛋白生物合成與光譜分析 (教案).doc

藻膽蛋白生物合成與光譜分析【課前預(yù)習(xí)】1無(wú)菌操作技術(shù)。2凝膠電泳、鋅電泳、親和層析技術(shù)的基本原理?！灸康囊蟆?了解藻膽蛋白生物合成的途徑2掌握藻膽蛋白純化的基本方法。3熟悉用分光光度計(jì)和熒光光譜儀測(cè)定藻膽蛋白光譜特性的方法?！净驹怼吭迥懙鞍祝╬hycobiliprotein）是一類結(jié)構(gòu)相似的色素蛋白。它是由藻膽色素通過(guò)和相應(yīng)的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價(jià)結(jié)合形成的。根據(jù)色素種類及其與藻膽蛋白的相互作用，藻膽蛋白可分為藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，簡(jiǎn)稱PC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，簡(jiǎn)稱PE）和別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，簡(jiǎn)稱APC），在某些沒有藻紅蛋白而具有異形胞的藍(lán)藻中，還有藻紅藍(lán)蛋白（phycoerythrocyanin，簡(jiǎn)稱PEC）。每種藻膽蛋白分別由各自的a亞基和亞基構(gòu)成（部分藻膽蛋白中還存在亞基）。藻膽蛋白通過(guò)脫輔基蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和藻膽色素相互作用，形成特定的構(gòu)象，使其主要吸收450660nm范圍內(nèi)的可見光。藻膽蛋白所能捕獲的光能正好可以填補(bǔ)葉綠素和類胡蘿卜素所不能捕獲的光能區(qū)（圖1）。捕獲的光能由高能色素流向低能色素，最終傳遞到光合作用中心。 圖1 色素蛋白吸收光譜藻膽色素是一類線性四吡咯化合物（分子量約600Da）。藻膽體中一般含有300800個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的藻膽色素。與藍(lán)藻藻膽蛋白結(jié)合的色素有4種。這四種色素分別是：藻紅膽素（phycoerythrobilin，簡(jiǎn)稱PEB）主要存在于PE中，藻藍(lán)膽素（phycocyanobilin，簡(jiǎn)稱PCB）主要存在于PC，APC和PEC中，藻尿膽素（phycourobilin，簡(jiǎn)稱PUB）主要存在于B-PE和R-PE中，藻紫膽素（phycoviolobilin，簡(jiǎn)稱PVB）僅存在于PEC中。藻膽色素來(lái)源于血紅素，血紅素被氧化而共軛環(huán)斷裂形成膽綠素，這一過(guò)程是由相應(yīng)的血紅素氧化酶催化。膽綠素被特定的酶部分還原和異構(gòu)化形成特定的藻膽色素（圖2）。圖2 藻膽膽素生物合成途徑藻膽色素與多肽鏈的保守性Cys殘基形成硫醚鍵共價(jià)連接，連接過(guò)程是由相應(yīng)的裂合酶催化（表1）。在藍(lán)藻中，藻膽色素均通過(guò)3位與多肽鏈中保守的半胱氨酸殘基形成硫醚鍵而共價(jià)連接，并通過(guò)與蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，形成特定的構(gòu)象，使藻膽蛋白主要吸收450660nm范圍內(nèi)的可見光。表1 裂合酶催化類型裂合酶類型催化產(chǎn)物E/F-型PCB-CpcA，PVB-PecAS/U-型CpcB-C84-PCB，PecB-C84-PCB，CpeA-C84-PEB，CpeB-C84-PEB ，ApcA,B,D,F-PCBT-型CpcB-C155-PCB ，PecB-C155-PCB【實(shí)驗(yàn)用品】1材料：菌種（E.coli，BL21）2器材和儀器：紫外分光光度計(jì)、熒光光譜儀、層析實(shí)驗(yàn)冷柜、pH計(jì)、紫外檢測(cè)儀、高速冷凍離心機(jī)、超聲破壁儀、制冰機(jī)、低溫恒溫槽、電泳儀、振蕩培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、高壓滅菌鍋3超聲緩沖液 0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.24親和層析法提純蛋白質(zhì)溶液0.5mol/L 氯化鎳柱平衡液：0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.2洗脫液：50mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、50mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2)洗脫液：500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl 、50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)透析液：50mmol/L KPP,0.5mol/L NaCl，pH7.25LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：1蛋白胨、0.5酵母粉、1 NaCl，pH7.0固體培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基中加入1.5瓊脂6SDS-PAGE電泳溶液5Tris-甘氨酸電泳緩沖液：15.1g Tris堿、94g甘氨酸(pH8.3)、50mL 10 SDS1SDS凝膠加樣緩沖液：50mmol/L TrisCl(pH6.8)、100mmol/L DTT、2 SDS(電泳級(jí))、0.1溴酚藍(lán)、10甘油（DTT配制成1mol/L儲(chǔ)存液，-20C保存，用前加入）2SDS凝膠加樣緩沖液：100mmol/L TrisCl(pH6.8)、200mmol/L DTT、4 SDS(電泳級(jí))、0.2溴酚藍(lán)、20甘油脫色液：由90mL甲醇:水（1:1，V:V）與10mL冰乙酸混合而成染色液：在100mL脫色液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R2507抗生素儲(chǔ)備液氯芐青霉素儲(chǔ)備液：用無(wú)菌二次重蒸水配成100mg/mL氨芐青霉素（ampicillin，簡(jiǎn)稱Amp）溶液，分裝，-20C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)每毫升培養(yǎng)基加入0.71mL，終濃度為70100mg/mL。卡納霉素儲(chǔ)備液：用無(wú)菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，簡(jiǎn)稱Kan）溶液，分裝，-20C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)每毫升培養(yǎng)基加入35mL，終濃度為3050mg/mL。氯霉素儲(chǔ)備液：用無(wú)水乙醇配成34mg/mL氯霉素溶液，分裝，-20C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)每毫升培養(yǎng)基加入0.60.8mL，終濃度為2027mg/mL。鏈霉素儲(chǔ)備液：用無(wú)菌二次重蒸水配成20mg/mL鏈霉素溶液，分裝，-20C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)每毫升培養(yǎng)基加入2.53.0mL，終濃度為5060mg/mL。8IPTG儲(chǔ)備液：將2g異丙基硫代-b-D-半乳糖苷（isoprophyl thio-b-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG），溶于二次重蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝，-20C保存?zhèn)溆谩！痉椒ú襟E】1活化菌種：取保藏的工程菌菌種10 l接入裝有5 ml的LB液體培養(yǎng)基的試管（不同的藻膽蛋白生物合成需要不同的抗生素）中，于37搖床振蕩培養(yǎng)8-12小時(shí)。2擴(kuò)大培養(yǎng)：將試管中活化的1 ml菌液接種到250 ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入對(duì)應(yīng)的抗生素，培養(yǎng)基于37搖床振蕩培養(yǎng)。3色素蛋白生物合成：工程菌培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6，10水浴中放置1 hr，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，20低溫過(guò)夜誘導(dǎo)后離心收集細(xì)胞，二次蒸餾水洗兩次。4色素蛋白純化： 將洗好的細(xì)胞重懸于一定量的超聲緩沖液中，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞5 min，然后于12000g離心15 min。取上清加到用柱平衡液預(yù)平衡好的Ni2親和層析柱上，三次柱平衡液洗柱，洗脫雜蛋白采用洗脫液，收集色素蛋白采用洗脫液。洗脫產(chǎn)物用透析液透析三次，每4小時(shí)換一次透析液以去除咪唑。5色素蛋白電泳檢測(cè) （1）安裝雙垂直板電泳槽； （2）配膠：12%的分離膠15 ml，濃縮膠5 ml；（3) 制樣：取樣品10 1加樣品緩沖液40 1混合，100加熱5 min，12000g，4離心1 min；（4）上樣：用微量注射器加樣15-20 1；（5）電泳：在凝膠上加80V/cm電壓，待前沿指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓提高到140V/cm繼續(xù)電泳直到指示劑到達(dá)底部；（6）鋅染色：電泳膠室溫下經(jīng)1.5 mol/L醋酸鋅溶液浸泡30分鐘后，在280nm紫外燈下檢測(cè)。紫外燈照射下拍照；（7）清洗：將已拍照的凝膠用二次重蒸水清洗2次；（7）固定和染色：用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液浸泡；（8）脫色：用脫色液處理直到膠板呈現(xiàn)淺藍(lán)色。6光譜分析 吸收光譜用紫外可見光譜儀，紫外可見光譜掃描范圍300800nm，掃描速度960nm/min，狹縫寬度1.0nm。熒光光譜用熒光光譜儀，熒光光譜掃描速度1200nm/min ,狹縫寬度5.0nm?！窘Y(jié)果與分析】1提純樣品2電泳的結(jié)果3吸收和熒光圖譜【注意事項(xiàng)】1藻膽蛋白生物合成過(guò)程必須在低溫、避光條件下進(jìn)行。2超聲波破壁時(shí)必需在冰上進(jìn)行，否則因升溫導(dǎo)致藻膽蛋白的失活，影響最終的光譜?！舅伎碱}】1提交藻膽蛋白的純化結(jié)果，包括光譜和電泳圖譜。2討論實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和結(jié)果?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Tooley A J, Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. Proc Natl Acad Sci USA, 2001；98(19):10560105652Tooley A J, Glazer A N. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol, 2002；184(17):466646713Zhao KH, Su P, Li J, Tu JM, Zhou M, Bubenzer C, Scheer H. Chromophore attachment to phycobiliprotein beta-subunits: phycocyanobilin:cysteine-beta84 phycobiliprotein lyase activity of CpeS-like protein from Anabaena Sp. PCC7120. J Biol Chem. 2006；281(13):8573-814Zhao KH, Su P, Tu JM, Wang X, Liu H, Plscher M, Eichacker