【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）鹽脅迫下紫花苜蓿根系蛋白質(zhì)組的初步分析草業(yè)生物技術(shù)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 鹽脅迫下紫花苜蓿 根系 蛋白質(zhì)組 的初步分析 of .) of .) I 摘 要 土地鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。利用生物技術(shù)提高牧草和農(nóng)作物耐鹽堿性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鹽堿地的有效利用和改良，而克隆耐鹽堿相關(guān)基因 、 研究耐鹽堿調(diào)控機(jī)制，是通過基因工程 手段 提高植物耐鹽 堿 性的基礎(chǔ)。 本文以高耐鹽苜蓿品種“中苜一號(hào)”為試驗(yàn)材料，應(yīng)用雙向 凝膠電泳技術(shù)對(duì)其根系蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜進(jìn)行差異分析。本試驗(yàn)對(duì)雙向電泳的 一 些重要技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行探討，對(duì)其過程中蛋白質(zhì)樣品 的 制備、等電聚焦、平衡、凝膠染色等幾個(gè)重要環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化。通過比較研究 ， 得出酚抽提法適合紫花苜蓿根系總蛋白質(zhì)的提??；改良的膠體考馬斯亮蘭方法是較靈敏且重復(fù)性高的蛋白質(zhì)染色方法；建立了適合紫花苜蓿的 2用優(yōu)化的雙向電泳方法，對(duì)鹽脅迫下苜蓿根系蛋白質(zhì)組進(jìn)行差異分析， 共得到 533個(gè)蛋白點(diǎn)，其中 59 個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量發(fā)生改變，改變量超過2 倍，其中 17 個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)， 42 個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下將 ，并對(duì)其分子量、 進(jìn)行了初步理論鑒定 。本試驗(yàn)將蛋白質(zhì)組學(xué)的新方法應(yīng)用于苜?？鼓鏅C(jī)制的研究，也展示了 可 將其應(yīng)用于牧草的其它研究的可能性。 關(guān)鍵詞 ： 紫花苜蓿根系，鹽脅迫，雙向凝膠電泳，質(zhì)譜 he of of of to of of is to of of of by as to on of by of as of we of is of we a to So we a is in of of of 33 59 17 42 D .0 to of pH of in of in 錄 2007 . 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 英文縮略表 . 0 第一章 文獻(xiàn) 綜述 . 1 白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展 . 1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念 . 1 蛋 白質(zhì)組學(xué)內(nèi)容 . 1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法 . 2 向聚丙烯酰胺凝膠電泳 (2. 2 譜 (技術(shù) . 3 白質(zhì)芯片 (技術(shù) . 4 酵母雙雜交系統(tǒng) (. 5 物信息學(xué)技術(shù) . 5 物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展 . 6 植物器官或組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 . 6 物亞細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 . 7 綠體的蛋白質(zhì)組研究 . 7 粒體蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 8 物膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究 . 8 植物細(xì)胞核和核仁蛋白質(zhì)組研究 . 9 白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于植物逆境脅迫研究的進(jìn)展 . 9 高溫脅迫 . 9 低溫脅迫 . 10 水分脅迫 . 10 鹽脅迫 . 11 氧化脅迫 . 11 機(jī)械傷害 . 11 第二章 材料與方法 . 13 料 . 13 驗(yàn)材料 . 13 實(shí)驗(yàn)試劑 . 13 實(shí)驗(yàn)儀器 . 13 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制 . 13 法 . 14 白質(zhì)提取 . 14 酮沉淀法 . 14 酚 /醋酸銨抽提法 . 14 白質(zhì)濃度測(cè)定 . 15 一向固相 度等電聚焦 . 15 條的平衡 . 16 二向 泳 . 17 膠染色 . 17 染 . 17 良的膠體考染法 . 18 泳凝膠圖像分析 . 18 白質(zhì)凝膠斑點(diǎn)切取 . 19 白質(zhì)質(zhì)譜分析 . 19 白質(zhì)膠內(nèi)酶解 . 19 白質(zhì)樣品脫鹽 . 19 質(zhì)量指紋圖譜法鑒定蛋白質(zhì) （ S） . 20 S 數(shù)據(jù)分析 . 20 第三章 結(jié)果與分析 . 21 花苜蓿根系蛋白質(zhì)的提取及雙向電泳條件的優(yōu)化 . 21 同蛋白質(zhì)提取方法的比較、選擇 . 21 白提取液和裂解液的選用 . 23 白上樣量的確定 . 24 向等電聚焦條件的優(yōu)化 . 25 衡條件的優(yōu)化 . 25 向 泳條件的優(yōu)化 . 26 色方法的比較 . 27 膠圖像分析 . 28 花苜蓿雙向電泳圖譜分析 . 29 脅迫下紫花苜蓿根系蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)分析 . 30 第四章 全文結(jié)論 . 35 參考文獻(xiàn) . 36 附錄 . 41 致 謝 . 43 作 者 簡(jiǎn) 歷 . 44 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 0 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 2雙向 凝膠電泳 pH 固相化 度 電點(diǎn)聚焦 道爾頓 硫蘇糖醇 二胺四乙酸二鈉 -(-(3 胺 丙 基 )血清白蛋白 睛 烯酞胺 ,N,N丙烯酞胺 4肉桂酸 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 附飛行時(shí)間質(zhì)譜 譜 肽質(zhì)指紋圖譜 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮 二烷基磺酸鈉 四甲基乙二胺 三 羥 甲基氨基甲烷 電點(diǎn) 三氯乙酸 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文 獻(xiàn) 綜述 1 第一章 文 獻(xiàn) 綜述 白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念 蛋白質(zhì)組 (名稱由澳大利亞的 于 1995 年第一次在 他將之定義為由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。 現(xiàn)在，該概念得到擴(kuò)展，即在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 、翻譯后的修飾、 蛋白質(zhì)的相互作用等，以此獲得 在 蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生 、 細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。 蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著 組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變。在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以多種 且同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾，例如磷酸化、糖基化等，故一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時(shí)可以超過基因組的數(shù)目。而且，基因組在幾乎所有的細(xì)胞中都是完整的，與之不同，蛋白質(zhì)組具有很高的細(xì)胞特異性，一個(gè)有機(jī)體的不同細(xì)胞表達(dá)它的全蛋白的不同亞套。同時(shí)，基因組儲(chǔ)存了穩(wěn)定的信息，其成分不隨時(shí)間變化，而蛋白質(zhì)組是高度動(dòng)態(tài)的，根據(jù)特異的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)而動(dòng)態(tài)表達(dá)。蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動(dòng)態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對(duì)基因 表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測(cè)定，以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。 蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)容 蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)的功能模式兩個(gè)方面。蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)內(nèi)容 ,主要是研究特定條件下某一細(xì)胞或組織的所有蛋白質(zhì)的表征問題。常規(guī)的方法是提取蛋白質(zhì) ， 經(jīng) 2 ( 分離形成一個(gè)蛋白質(zhì)組的二維圖譜 ,通過計(jì)算機(jī)圖像分析得到各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、表達(dá)量等 ， 再結(jié)合以質(zhì)譜分析為主要手段的蛋白質(zhì)鑒定 ,建立起細(xì) 胞或組織或機(jī)體在所謂“正常生理?xiàng)l件下”的蛋白質(zhì)組圖譜和數(shù)據(jù)庫。然后 ， 在此基礎(chǔ)上 ， 可以比較分析在變化了的條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化 ， 如蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化、翻譯后的加工修飾、蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上定位的改變等 ， 從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特定功能的蛋白質(zhì)及其基因。 蛋白質(zhì)功能模式的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要目標(biāo) 。 無論是基因組研究還是蛋白質(zhì)組研究 ,最終目標(biāo)是揭示所有基因或蛋白質(zhì)功能及其作用模式 。 一方面 ， 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與 間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)及代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。另一方面 ， 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮 其功能的前提 ， 對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)也成為了解大量涌現(xiàn)的新基因功能的一個(gè)重要途徑。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文 獻(xiàn) 綜述 2 根據(jù)研究目的的不同 ， 蛋白質(zhì)組學(xué)研究又可以細(xì)分為下列領(lǐng)域：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)（ 指大規(guī)模的研究蛋白質(zhì)表達(dá)差異，類似于基因的差異表達(dá)分析，它包括細(xì)胞或組織的全蛋白表達(dá)譜（ 在不同條件下蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析（ in ， 該方面主要借助 2術(shù)和圖像分析， 可在整個(gè)蛋白組水平上研究細(xì)胞通路 ； 細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)（ 它的目的是識(shí)別蛋白質(zhì)的相互作用，闡明細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)，該策略對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究有重要的意義，主要研究方法包括酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù) ； 功能蛋白質(zhì)組學(xué)（ 隨著基因組學(xué)的深入進(jìn)行， 1997 年提出了功能蛋白組學(xué)的概念，即研究細(xì)胞內(nèi)于某個(gè)功能相關(guān)或某種條件下的表達(dá)的一組蛋白 ； 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組（ 大規(guī)模高通量地測(cè)定表達(dá)蛋白質(zhì)的三 維結(jié)構(gòu)，在基因組規(guī)模上確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 2， 通過對(duì)其結(jié)構(gòu)的了解，以理解其生理功能。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法 相對(duì)于基因分析而言 , 在一個(gè)分析體系內(nèi) , 蛋白質(zhì)的種類十分繁多 , 常?？蛇_(dá) 10000 種以上 ,而且不能夠體外擴(kuò)增增加其含量。因此 ,要實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的大規(guī)模 ,自動(dòng)化系統(tǒng)分析 ,研究方法和技術(shù)面臨很大挑戰(zhàn) ， 需要滿足以下要求 : (1) 高效提取和分離所有蛋白質(zhì)組分 ； (2) 準(zhǔn)確鑒別和定量分析每一組分 ； (3) 能夠比較分析表達(dá)圖譜的復(fù)雜變化 。 其中蛋白質(zhì)所有組分的完全分離是蛋白質(zhì)組研究的前提條件。目前最主要的方法之一是雙向凝膠電泳分離復(fù)雜 成分 ， 利用專門軟件進(jìn)行圖象分析 , 之后采用氨基酸組成分析 , 序列分析 , 質(zhì)譜分析等技術(shù)進(jìn)行精細(xì)鑒定。 向聚丙烯酰胺凝膠電泳 (2蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心。 1975 年 O 先建立了等電聚焦 聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳 ( E) 分離和分析蛋白質(zhì)組分的技術(shù) 3。這一技術(shù)應(yīng)用兩個(gè)不同分離原理依據(jù)蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行分離 。 第一相依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷量的不同 ， 用等電點(diǎn)( 聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)。第二相是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的差別 , 通過蛋白質(zhì)與 成復(fù)合物后 ， 在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速率不同達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 4。 雙向電泳體系有 種 。 O首先提出的是 等電 ,道 爾頓 )， 使用了 9L 尿素、 2 % 4 %T、 5 %C 的管狀載體兩性電解質(zhì)(凝膠等電聚焦為第一向。聚焦后在含 用瓊脂糖包埋在垂直板狀 膠的濃縮膠上 ， 用不連續(xù) 度凝膠電泳作二向 ， 用放射自顯影方法 ， 得到了 5000 個(gè)蛋白點(diǎn)的圖譜。 載體兩性電解質(zhì) 度是在電泳過程中形成 ， 度不穩(wěn)定 ， 受電場(chǎng)和時(shí)間影響大 ， 重復(fù)性不好 ； 且陰極飄移會(huì)造成堿性蛋白質(zhì)的丟失。因此隨著 1982 年固相 度 ( pH 等電聚焦技術(shù)的完善 , 步替代了 發(fā)展成3。 比有以下優(yōu)點(diǎn) : 分辨率高 ， 可達(dá) 010001 圍靈活 ， 可檢測(cè)堿性蛋白 ， 并且能得到 12 范圍的雙向圖譜 ； 度是由 價(jià)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文 獻(xiàn) 綜述 3 結(jié)合到凝膠中 ， 在凝膠聚合時(shí)形成 ， 不受脫水、泡脹、電場(chǎng)因素影響 ， 度十分穩(wěn)定 ， 電泳重復(fù)性好 ； 上樣量大 ， 平衡時(shí)蛋白質(zhì)不易被洗脫 ， 易于轉(zhuǎn)移到第二向膠 ， 因此 成為雙向電泳的核 心技術(shù)。但是 其導(dǎo)電性比載體兩性電解質(zhì)的導(dǎo)電性低100倍 ,需使用高電壓。 隨著超靈敏度質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展 ， 發(fā)現(xiàn)雙向凝膠電泳并不能將所有蛋白質(zhì)完全分離 ， 許多斑點(diǎn)仍為兩個(gè)或更多蛋白的混合物。此外 ， 在其應(yīng)用中仍然存在很多局限 : (1) 樣品上樣量小 ， 使蛋白檢測(cè)的靈敏度受到限制 ； (2) 電泳結(jié)果須經(jīng)染色處理 ， 不能直接分析 ， 并且不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合差異較大 ； (3) 分子量過大 ( 100000)或 過小 ( 10000 6 迅速移走上清； 7 再次短暫離心，移走剩余上清； 8 每管加入 100400浮沉淀； 9 加入 1A:B=100： 1混合），倒置混勻； 10室溫孵育 15 11以水做空白， 480 12做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度。 注意事項(xiàng)： 1 工作液 4放置一星期，但用前要確保其在 480 2 加入工作液后 15測(cè)定吸光值； 3 步驟 6要迅速，以免沉淀復(fù)溶，可不完全吸干。 一向固相 度等電聚焦 1. 根據(jù)膠條長(zhǎng)度、 圍、蛋白質(zhì)溶液濃度計(jì)算吸取適量蛋白溶液，用 蛋白 水化液稀釋定容到所需上樣量 ， 加入到相應(yīng)型號(hào)的膠條槽中。 2. 從酸性端（尖端）一側(cè)剝?nèi)?條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將 陽性端 )朝標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動(dòng)，避免生成氣泡， 最后放下條平端 (陰極 )，使水化液浸濕整個(gè)膠條，并確保膠條的兩端與槽的兩端的電極接觸。 3. 條上覆蓋適量 蓋油，蓋上蓋子。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 16 4. 將標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端背面電極與 器的陽極平臺(tái)接觸；膠條槽的平端背面電極與 器的陰極平臺(tái)接觸。 5. 設(shè)置 器運(yùn)行參數(shù)： 條水化的電壓，溫度和時(shí)間；等電聚焦電泳時(shí)的梯度電壓和溫度（如下所示） 6. 條水化后可自動(dòng)進(jìn)行等電聚焦電泳。 7. 等電聚焦完成后， 暫時(shí)不進(jìn)行第二向的 條 可夾在兩層塑料薄膜中于 保存幾個(gè) 9月。 11 水化 50V 1217） 主動(dòng)水化 250V 線性 30分鐘 除鹽 1000V 快速 30分鐘 除鹽 8000V 線性 4小時(shí) 升壓 8000V 快速 40,000伏小時(shí) 聚焦 500V 快速 任意時(shí)間 保持 選擇所放置的膠條數(shù)； 設(shè)置每根膠條的極限電流（ 50）；設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度（ 20） 17 水化 50V 1217） 主動(dòng)水化 250V 線性 30分鐘 除鹽 1000V 快速 1小時(shí) 除鹽 10000V 線性 5小時(shí) 升壓 10000V 快速 60,000伏小時(shí) 聚焦 500V 快速 任意時(shí)間 保持 選擇所放置的膠條數(shù)；設(shè)置每根膠條的極限電流（ 50）；設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度（ 20）。 條的平衡 1. 使用前 取適量平衡緩沖液 511 1024加入 濃度為1，作為平衡液 。 取出 條分別放入玻璃管中 (支持膜貼著管壁，每個(gè)玻璃管中放入一條 條 )， 用 口， 振蕩儀上振蕩 15分鐘，倒掉平衡緩沖液 I。 2. 前取適量平衡緩沖液 511 1024加入碘乙酰 銨，終濃度為 作為平衡液。從平衡液中取出 條，放入平衡液中，用 口，振蕩儀上振蕩 15 分鐘。 3. 取出 條，用去離子水潤(rùn)洗 條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分 鐘，去除多余的平衡緩沖液。 4. 條的轉(zhuǎn)移：將 條放在位于玻璃板之間的凝膠面上，使膠條支持膜貼著其中的一塊玻璃板，用一薄尺將 條輕輕地向下推，使整個(gè)膠條下部邊緣與板膠的上表面完全接觸。確保在 條與板膠之間以及玻璃板與塑料支持膜間無氣泡產(chǎn)生。 5. 最后用瓊脂糖密封液進(jìn)行封頂，用少量 的密封液（ 約 使 此過程中不要產(chǎn)生氣泡。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 17 二向 泳 按儀器說明書裝好灌膠模具，倒入凝膠溶液 （見附錄），預(yù) 先制備 冷循環(huán)水浴儀溫度設(shè)定 12。 開溫控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度為 12 。 條小心的放置在 面上，并輕壓使 條與 面充分結(jié)合，上面覆蓋 275 ），使瓊脂糖在 5分鐘內(nèi)凝固。 通電源，起始時(shí)用的低電流（ 5mA/1 功率（ 4，待樣品在完全走出 縮成一條線后，再加大電流 （ 201 功率（ 14W/ 4，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。 備染色。 膠染色 染 1. 固定： 100 25 加水到 250ml i. 30分鐘 或者更長(zhǎng)時(shí)間 2. 致 敏： 75 17 i. 加水到終體積 25030分鐘 3. 水洗： 用 次，每次 5分鐘 4. 銀染： 100 加水到終體積 250i. 20分鐘 5. 水洗： 用 次，每次 1分鐘 6. 顯色： 100醛 ， 加水到終體積 250ml i. 37. 終止： 加水到終體積 250i. 10分鐘 8. 保存： 1% 冰醋酸， 4 注意事項(xiàng)： 保證所有的染色器皿絕對(duì)的干凈，可使用玻璃 或塑料做染色器皿； 水的純度對(duì)染色結(jié)果好壞影響是很大的，至少要用雙蒸水（導(dǎo)電率 2 S），有條件的可使用 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 18 染色過程中避免手去接觸凝膠，必須戴上一次性手套或無粉乳膠手套； 所用的化學(xué)試劑一定是要分析純（ 良的膠體考染法 1. 固定 : 100 25 加水到 2500分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間 2. 水洗 : 用 次，每次 15分鐘 3. 染色 : ( 10% 硫酸銨 , 10% 磷酸 0% 甲醇 ) 過夜 4. 脫色 : 去離子水至背景清楚 泳凝膠圖像分析 電泳凝膠通過 100描儀獲得圖像，凝膠圖像經(jīng)過 D 得蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的等電點(diǎn)、分子量、相對(duì)表達(dá)豐度以及凝膠之間蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配的信息。 蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)在凝膠上的條帶位置分別確定標(biāo)準(zhǔn)線，通過軟件計(jì)算出各蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的分子量。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)根據(jù)線性 條的特點(diǎn)，通過軟件在 3 4范圍內(nèi)進(jìn)行等分，獲得各蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)。 蛋白質(zhì) 的表達(dá)豐度是通過蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在凝膠上的體積（ 算出來的。軟件設(shè)計(jì)的算法是通過對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在膠上的實(shí)際體積進(jìn)行均一化處理，計(jì)算出其相對(duì)體積（ V）， 表了蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)豐度（ 過下面的公式計(jì)算得到，即用每個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的實(shí)際體積值（ 以整塊凝膠上全部蛋白質(zhì)斑點(diǎn)體積值的總和（ ），從而得到每個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的相對(duì)體積（ ）。 只有那些在每 一個(gè)樣品的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都存在的點(diǎn)才被認(rèn)為是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。只在 對(duì)照 樣品和 脅迫 樣品之一中存在的點(diǎn)被認(rèn)為是該樣品特有的點(diǎn)。將兩個(gè)樣品中穩(wěn)定存在并能夠匹配的點(diǎn)進(jìn)行相對(duì)表達(dá)豐度的比較，通過對(duì)各點(diǎn) 的進(jìn)行方差分析后得到的差異顯著（ P 點(diǎn)被認(rèn)為是表達(dá)豐度發(fā)生變化的點(diǎn)。 D 1. 建立一個(gè)工作區(qū) 2. 觀察和校準(zhǔn)凝膠 3. 檢定和定量蛋白點(diǎn) 4. 注釋蛋白點(diǎn)和象素： 5. 匹配凝膠圖像 6. 分析數(shù)據(jù) 7. 整合數(shù)據(jù) 8. 報(bào)告結(jié)果 1 nn 1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 19 9. 控制和自動(dòng)化凝膠分析 白質(zhì)凝 膠斑點(diǎn)切取 本實(shí)驗(yàn)中 凝膠斑點(diǎn) 主要 用手工制作的切膠筆手工切取。 有條件的情況下， 蛋白質(zhì)凝膠斑點(diǎn)的切取 可以 通過蛋白質(zhì)凝膠斑點(diǎn)切取儀（ 成， 將需要切取的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的坐標(biāo)值在軟件中列表，切取儀將按照列表逐一切取凝膠并按順序放到指定的 96孔板