上海交大網(wǎng)絡課程檢驗微生物講義

第十二章 弧菌科一、教學大綱要求（1）弧菌科的分類和特性。（2）霍亂弧菌和副溶血弧菌的分類、臨床意義、細菌特性、實驗室檢查和耐藥性。（3）氣單胞菌和鄰單胞菌的分類、臨床意義、細菌特性、實驗室檢查和耐藥性。二、教材內(nèi)容精要（一）弧菌屬的分類及主要特點弧菌屬（Vibrio）在分類上屬于弧菌科，共有36個種，其中14種弧菌已被證明引起人類感染并可從臨床標本中分離得到，包括引起腸道感染的O-1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌、非O1群霍亂弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、霍利斯弧菌；引起傷口感染、中耳炎和敗血癥等腸道外感染的溶藻弧菌、辛辛那提弧菌、創(chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、少女弧菌、麥氏弧菌和鯊魚弧菌。其余為海洋性弧菌與人類感染無關(guān)。本屬除麥氏弧菌外氧化酶均陽性，能發(fā)酵葡萄糖，對弧菌抑制劑O/129敏感，鈉離子能刺激其生長，其中有些種在無鹽條件下不能生長；營養(yǎng)要求不高，許多致病性弧菌在普通培養(yǎng)基上可生長，在血平板上可呈現(xiàn)、溶血或不溶血菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上，許多致病性弧菌可生長形成乳糖不發(fā)酵菌落。（二）霍亂弧菌1分類（1）血清分型 霍亂弧菌（V.cholerae）有不耐熱的H抗原和耐熱的O抗原。前者為共同抗原，特異性低，后者具有群特異性和型特異性，是霍亂弧菌分群和分型的基礎(chǔ)。根據(jù)O抗原的不同，霍亂弧菌現(xiàn)有155個血清群，其中僅O1群和O139群引起霍亂。O139血清群是新出現(xiàn)的型別，與O1群抗血清無交叉反應，但可與O22和O155血清群產(chǎn)生交叉反應，遺傳學特征和毒力基因與O1群相似。O2血清群O138血清群可引起人類的胃腸炎，無明顯的季節(jié)分布，不引起霍亂流行，不被O1群霍亂弧菌多價血清所凝集，稱之為非O1群霍亂弧菌，以往也稱不凝集弧菌或非霍亂弧菌。O1群霍亂弧菌的O抗原由A、B、C三種抗原成分組成，A是O1群的群特異性抗原，通過三種抗原成分的不同組合可分成三個型別:AB構(gòu)成小川型、AC構(gòu)成稻葉型、ABC構(gòu)成彥島型。彥島型的抗原性不穩(wěn)定，各型之間可以相互轉(zhuǎn)換，以小川型和稻葉型為常見流行型別。（2）生物型 根據(jù)生物學特性，O1群霍亂弧菌可分為古典生物型和El-Tor生物型，兩個生物型具有相同的血清型。El-Tor生物型是具有溶血性的生物型，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)El-Tor生物型細菌在環(huán)境中的抵抗力、存活力更強，在我國流行的以El-Tor小川型為主。（3）噬菌體分型 根據(jù)霍亂弧菌對噬菌體的裂解模式不同進行分型，得到32個型，其中第組和第組噬菌體較為實用，前者以裂解古典生物型為主，后者僅對El-Tor生物型有高度特異性。2細菌特性（1）形態(tài)染色 革蘭染色陰性，呈弧形或逗點狀，菌體尾端有一鞭毛，運動活潑，懸滴鏡檢可見穿梭狀運動，患者糞便直接涂片可見弧菌縱列呈“魚群”樣，O139群弧菌亦為單端單鞭毛，有莢膜。（2）培養(yǎng)特性 需氧或兼性厭氧菌，在1644均可生長，最適生長溫度37；營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，耐堿，在pH6.810.2范圍均可生長，一般增菌培養(yǎng)常用pH8.48.6的1堿性蛋白胨水進行選擇性增菌。常用的選擇性培養(yǎng)基有硫代硫酸鈉-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS平板），霍亂弧菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，菌落呈黃色；4號瓊脂和慶大霉素瓊脂平板，因含亞碲酸鉀，霍亂弧菌在其上生長將培養(yǎng)基中的碲離子還原成元素碲，形成灰褐色菌落。血平板上菌落較大，El-Tor生物型可形成溶血環(huán)?？稍跓o鹽培養(yǎng)基上生長，但在含有高于60g/L氯化鈉的培養(yǎng)基上不能生長；O139群霍亂弧菌能在無鹽及30g/L氯化鈉蛋白胨水中生長，不能在80g/L濃度下生長。（3）生化反應 氧化酶、明膠液化和吲哚試驗陽性，發(fā)酵蔗糖和甘露醇，賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性?；魜y弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區(qū)別見表12-1。（4）抵抗力 霍亂弧菌對干燥、熱、酸和消毒劑均敏感，但在自然環(huán)境中存活時間較長， O139群霍亂弧菌在水中存活時間較O1群霍亂弧菌長。 表12-1 霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區(qū)別特征古典生物型El-Tor生物型羊紅細胞溶血-D雞紅細胞凝集-+VP試驗-+CAMP試驗-+多粘菌素B敏感試驗+-組噬菌體裂解+-組噬菌體裂解-+注：+，90陽性；-，90陰性；D，10%89%陽性。3臨床意義霍亂弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的易感者。人通過攝入霍亂弧菌污染的食物或水，引起霍亂。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸黏膜表面的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過普通菌毛的作用定植。腸道內(nèi)的環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產(chǎn)生霍亂腸毒素，導致疾病的發(fā)生?；魜y弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內(nèi)水分和電介質(zhì)大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征。4.微生物學檢驗 (1)檢驗程序 見圖12-1。 標本（糞便、肛拭） 直接檢查 堿性蛋白胨水增菌6h8h直接 直接 霍亂 與O1 選擇性平板分離（TCBS、4涂片、 熒光 毒素 或O139群 號平板、慶大霉素瓊脂）動力、 抗體 測定 抗體制動 染色 玻片試驗 檢查 凝集試驗 可疑菌落 純培養(yǎng) 涂片革蘭 與O1群多 初步報告 染色 價血清或 O139群血清 革蘭陰性弧菌 做玻片凝集 氧化酶（） 試驗 涂片革蘭 生化鑒定、 染色 O1或O139 鏡檢 群血清玻 片凝集試驗 初報 報告圖12-1 霍亂弧菌的檢驗程序(2) 標本采集 霍亂是烈性腸道傳染病，檢驗標本主要以病人的大便為主，必要時嘔吐物和被嘔吐物污染的衣褲亦可作為標本。一般采取新鮮糞便，或用棉拭子插入直腸內(nèi)45cm采取。病人標本最好床邊接種，預計能在3h內(nèi)進行培養(yǎng)者，可將肛拭子置于滅菌的含堿性蛋白胨水的試管中，或?qū)?015ml大便放在帶蓋的廣口瓶中，送往實驗室。不能在3h內(nèi)進行接種或需送至較遠實驗室的，應將標本轉(zhuǎn)至卡-布半固體運送培養(yǎng)基中送檢，避免使用甘油鹽水緩沖運送培養(yǎng)基。送檢標本應密封并派專人送達。（3）檢驗方法 1）顯微鏡檢查 涂片染色:取病人“米泔水”樣或黏液絮狀糞便標本直接涂片，革蘭染色或1：10稀釋復紅染色，鏡檢；一般新鮮糞便中弧菌較典型，排列呈“魚群”狀，菌株隨人工培養(yǎng)傳代次數(shù)增加或菌落放置過久而逐漸變?yōu)椴坏湫偷亩虠U狀；動力觀察：可用懸滴法、壓滴法或暗視野顯微鏡觀察動力，霍亂弧菌運動活躍，新鮮糞便標本中常呈“穿梭樣”或“投標樣”運動；制動試驗：將病人“米泔水”樣糞便或6h的增菌液0.25ml同0.25ml適當稀釋的霍亂多價“O”免疫血清混合，5min后作暗視野或懸滴法檢查，并以生理鹽水與標本混合作為對照，有免疫血清存在時，菌體凝集成塊，動力消失；直接熒光抗體染色檢查和O1群抗原單克隆抗體凝集試驗，可快速診斷霍亂弧菌感染。2）分離培養(yǎng) 將標本直接接種于堿性蛋白胨水，或?qū)⑦\送培養(yǎng)基的表層接種于堿性蛋白胨水中3568h后，轉(zhuǎn)種至TCBS瓊脂或4號瓊脂或慶大霉素瓊脂平板，35培養(yǎng)1218h觀察菌落形態(tài)，TCBS上出現(xiàn)黃色菌落，4號瓊脂或慶大霉素平板上出現(xiàn)灰褐色中心的菌落，均為可疑菌落，應使用O1群和O139群霍亂弧菌的多價和單價抗血清進行玻片凝集試驗，結(jié)合菌落特征和菌體形態(tài)，作出初步報告。將與抗血清凝集的菌落進一步純培養(yǎng)，依據(jù)全面的生化反應、血清學分群及分型進行最后鑒定。符合霍亂弧菌的菌株尚需區(qū)分古典生物型和El-Tor生物型（表12-1）。3）鑒定 用于霍亂弧菌的鑒定試驗有：霍亂紅試驗:霍亂弧菌的兩種生物型均呈陽性反應，但是，本反應并非霍亂弧菌特有，許多能分解色氨酸和還原硝酸鹽的細菌，均能產(chǎn)生陽性反應；糖發(fā)酵試驗:霍亂弧菌分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵阿拉伯糖；粘絲試驗:弧菌屬細菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反應；O/129敏感試驗：參照藥敏試驗方法進行。將O/129 10g和150g的紙片貼在接種有待測菌的瓊脂平板上，35孵育1824h后，紙片周圍出現(xiàn)任何大小的抑菌環(huán)均為敏感；O1群和非O1群霍亂弧菌均敏感，但已有對O/129耐藥的菌株出現(xiàn)；O139群對O/129耐藥，用此試驗作鑒定時需特別謹慎，需結(jié)合其他試驗結(jié)果加以綜合考慮；耐鹽試驗:霍亂弧菌可在不含氯化鈉和含有6氯化鈉培養(yǎng)基中生長，氯化鈉濃度高于6則不生長。4）霍亂弧菌的生物分型試驗 見表121，這些試驗中，每種試驗都可能或多或少地存在例外情況，可根據(jù)實驗室具體情況采用數(shù)種試驗，多數(shù)符合，一般情況下即可判定霍亂弧菌的這兩個生物型。（4）耐藥性 致病性弧菌在MH培養(yǎng)基上生長良好，可用NCCLS規(guī)定的紙片擴散法進行體外抗生素藥敏試驗，常規(guī)測定氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、SMZ-TMP、呋喃唑酮。對于具有自限性的腹瀉而言，體外藥敏試驗并非必需，但對監(jiān)控弧菌的耐藥性發(fā)展趨勢有意義。（5）結(jié)果與報告 霍亂屬于法定的甲類傳染病，一旦從病人糞便標本中分離出霍亂弧菌，需立即向上級管理部門報告。（三）副溶血弧菌1細菌特性（1）形態(tài)染色特點 革蘭陰性直或微彎的桿菌，常呈多形性。在液體培養(yǎng)基中形成極端單鞭毛，在固體培養(yǎng)基上，菌體形成側(cè)鞭毛，運動活躍。無莢膜、無芽胞。（2）培養(yǎng)特性 需氧或兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，具有嗜鹽性，在無鹽或NaCl含量超過80g/L的培養(yǎng)基上不生長，最適NaCl濃度為35g/L，最適pH為7.78.0，最適生長溫度3037。（3）生化反應 氧化酶試驗陽性，能分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、覃糖、阿拉伯膠糖和淀粉產(chǎn)酸，不分解乳糖、蔗糖、纖維二糖、木膠糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、水揚苷。甲基紅、靛基質(zhì)、明膠液化、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶和硝酸鹽還原試驗陽性，VP、硫化氫、尿素酶和精氨酸雙水解酶陰性。（4）抗原 具有耐熱的菌體（O）抗原、有群特異性；在菌體抗原表面存在表面（K）抗原，不耐熱，能阻止O抗原發(fā)生凝集；還有鞭毛（H）抗原，不耐熱，無特異性。（5）抵抗力 抵抗力弱，不耐熱，在淡水中生存不超過2d，但在海水中能存活47d以上，耐堿怕酸。2臨床意義 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）具有嗜鹽性，存在于近海岸的海水、海底沉積物、海產(chǎn)品（魚類、貝類）及鹽漬的蔬菜、肉、蛋品等中，當人食入未煮熟的海產(chǎn)品或污染本菌的鹽漬食物而感染，潛伏期為610h不等，一般引起食物中毒和急性腹瀉，病程23d，通常有自限性。副溶血弧菌通過菌毛的黏附，產(chǎn)生兩種致病因子，一是耐熱性溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH），能耐受10010min不被破壞。動物試驗表明具有細胞毒性、心臟毒和腸毒性，與人或兔紅細胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合引起溶血，其致病性與溶血能力呈平行關(guān)系。另一致病因子為耐熱相關(guān)溶血素（TRH）,其功能與TDH相似。3微生物學檢驗（1）檢驗程序 見圖12-2。 糞便 可疑食物等 4NaCl蛋白胨水增菌 TCBS、嗜鹽菌選擇性平板 純培養(yǎng) 神奈川現(xiàn)象 菌種鑒定 或毒素測定 (耐鹽試驗和生化鑒定) 報告 圖12-2 副溶血弧菌的檢驗程序（2） 標本采集 首先采集病人糞便或肛拭子，其次是可疑食物，因本菌耐酸性弱，不易在嘔吐物中檢出，一般不采集患者嘔吐物作本菌檢查。標本采集后應盡快送檢。（3）檢驗方法1）顯微鏡檢查 一般不做直接鏡檢，必要時用分離培養(yǎng)的可疑菌落涂片革蘭染色或石炭酸復紅染色，同時做壓滴法或懸滴法檢測動力。本菌革蘭陰性，兩端濃染，帶有彎曲狀的桿菌，常呈多形性，表現(xiàn)為長桿狀、球狀或長絲狀。動力陽性，運動活躍僅次于霍亂弧菌。2）分離培養(yǎng) 標本增菌，需接種至含40g/L NaCl的蛋白胨水中，37培養(yǎng)，若有副溶血弧菌，一般數(shù)小時即出現(xiàn)混濁，并可在表面形成菌膜。本菌在TCBS瓊脂上可形成0.52.0mm大小、蔗糖不發(fā)酵的綠色或藍綠色菌落；在SS平板上不生長或長出12mm扁平無色半透明的蠟滴樣菌落，有辛辣味，不易刮下；在伊紅美藍平板上不能生長，在麥康凱平板上某些菌株不能生長，能生長者，菌落圓整、平坦、半透明或混濁，略帶紅色；從腹瀉病人中分離到的菌株95以上可出現(xiàn)神奈川現(xiàn)象（Kanagawa phenomenon，KP），即在含高鹽（70g/L）甘露醇的人O型血或兔血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。在不含NaCl或含100g/L的NaCl培養(yǎng)基上不生長，在含30g/L和70g/L的NaCl培養(yǎng)基上可生長。嗜鹽菌選擇性平板上，本菌可形成較大、中心微微隆起、稍混濁、半透明或不透明的無黏性的菌落。3）鑒定 根據(jù)本菌的形態(tài)染色、動力陽性、氧化酶陽性，在TCBS等培養(yǎng)基上的生長特點、NaCl生長試驗、神奈川現(xiàn)象陽性，各種生化反應鑒定、毒力試驗（可用免疫學方法測定TDA和TRH）等可作出鑒定。（四）氣單胞菌屬1細菌特性 革蘭陰性直桿菌，或呈球桿狀或絲狀，絕大多數(shù)有極端單鞭毛，動力陽性，但殺鮭氣單胞菌和中間氣單胞菌動力陰性，對人也無致病性。兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基可生長；生長溫度較廣（045），嗜溫菌于1042生長，動力陰性的嗜冷菌在不超過37（中間氣單胞菌）或更冷的條件下生長（殺鮭氣單胞菌），一些嗜溫菌在22比在37的生化反應更活潑。氧化酶、觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，發(fā)酵葡萄糖及其他多種糖類產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生多種酶類如淀粉酶、DNA酶、酯酶、肽酶、芳基酰胺酶和其他水解酶，除極少數(shù)菌株外，均對弧菌抑制劑O/129耐藥。具體生化反應見表12-2。 表12-2 氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬細菌的生化特征試驗嗜水氣單胞菌豚鼠氣單胞菌維氏氣單胞菌溫和生物型維氏氣單胞菌維氏生物型簡氏氣單胞菌舒氏氣單胞菌脆弱氣單胞菌類志賀氏鄰單胞菌氧化酶+DNA酶+ND+ND-尿素酶-ND-吲哚+-+精氨酸雙水解酶+-+賴氨酸脫羧酶+-+鳥氨酸脫羧酶-+-VP試驗+-+-葡萄糖產(chǎn)氣+-+-+-阿拉伯糖+-乳糖-+-ND-ND-蔗糖+-肌醇-+甘露醇+-+-水揚苷+-+-V纖維二糖V+VV-+-七葉苷水解+-+-溶血（羊血平板）+-+VV-頭孢噻吩RRSSRSRS氨芐西林RRRRRRSSO/129（10g/150g）R/RR/RR/RR/RR/RR/RR/RS/S注：+，90陽性；-，10陽性；ND，未定；S，敏感；R，耐藥2臨床意義本屬細菌自然棲生于水中，引起的疾病廣泛存在于哺乳動物（如人、鳥類等）和冷血動物（如鮭、魚、蛇等）中。在人類主要引起腸內(nèi)感染和腸外感染，前者主要表現(xiàn)為胃腸炎，患者通常呈癥狀較輕的水樣腹瀉，癥狀嚴重，呈血性糞便且便中有大量白細胞者（和志賀菌引起的痢疾很相似）較少見，本菌是夏季腹瀉的常見病原菌之一，主要致病物質(zhì)為溶血毒素和細胞毒素；后者包括敗血癥、傷口、眼、關(guān)節(jié)、腹腔內(nèi)及其他感染，主要與外傷后傷口接觸了污染的水有關(guān)。殺鮭氣單胞菌為嗜冷菌，通常存在于海水中引起魚類等感染，不引起人類感染。3微生物學檢驗（1）檢驗程序 見圖12-3。 糞便、膿汁、傷口分泌物 尿液 血液 離心取沉淀 肉湯增菌直接涂片 血平板或麥康凱平板革蘭染色 分離培養(yǎng) 35 1824h鏡檢 可疑菌落 全面生化反應 涂片革蘭染色 革蘭陰性桿菌 氧化酶（+） 報告圖12-3 氣單胞菌的檢驗程序（2）標本采集 根據(jù)不同疾病采集糞便、肛拭子、血液、膿汁、腦脊液和尿液等標本，糞便標本用卡-布氏培養(yǎng)基運送較為適宜。（3）檢驗方法 1）顯微鏡檢查 取膿汁、傷口分泌物等標本，革蘭染色、鏡檢，氣單胞菌屬細菌為革蘭陰性，兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，有薄莢膜；糞便懸滴檢查，本菌運動活躍。2）分離培養(yǎng) 本菌在大多數(shù)普通培養(yǎng)基上可生長，常用的有血平板、麥康凱平板、加有10u/ml氨芐西林的血平板和CIN瓊脂平板。在血平板上經(jīng)372448h培養(yǎng)后可形成白色、光滑濕潤、凸起、直徑為2mm左右的菌落，多數(shù)菌株有溶血環(huán)（豚鼠氣單胞菌不溶血），35d后菌落成暗綠色；在麥康凱平板上菌落無色，稍混濁無臭味，在液體培養(yǎng)基中呈混濁生長，在SS培養(yǎng)基和TCBS上不生長。3）鑒定與鑒別：氧化酶、觸酶陽性、在麥康凱平板上生長、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、還原硝酸鹽為亞硝酸鹽等為主要的鑒定試驗，全面的生化反應見表12-2。與鄰單胞菌和弧菌屬的鑒別常用O/129敏感試驗、TCBS生長試驗和耐鹽試驗進行鑒別。氣單胞菌屬間細菌的鑒別：嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌發(fā)酵阿拉伯糖，可與其他菌屬鑒別，兩者的主要鑒別點為前者VP試驗和賴氨酸脫羧酶陽性而后者均陰性；維氏氣單胞菌維氏生物型和溫和生物型的區(qū)別為前者精氨酸雙水解酶陰性、鳥氨酸脫羧酶陽性、七葉苷水解陽性而后者均相反，其他菌種間的鑒別見表12-2。（4）耐藥性 絕大多數(shù)氣單胞菌產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶，對青霉素、氨芐西林、羧芐西林、替卡西林耐藥，但對廣譜的頭孢菌素、氨基糖苷類抗生素、氯霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑和喹諾酮類藥物敏感，本菌屬中唯一對氨芐西林敏感的菌種是脆弱氣單胞菌，因此加入氨芐西林的選擇性培養(yǎng)基可使脆弱氣單胞菌漏檢。絕大多數(shù)維氏氣單胞菌溫和生物型對頭孢噻吩敏感，而嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌對頭孢噻吩耐藥