流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用摘要：隨著現(xiàn)代激光技術(shù)、電子檢測(cè)技術(shù)和電子計(jì)算機(jī)技術(shù)等的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞儀(FCM)在免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域中得到了更加廣泛的應(yīng)用。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，F(xiàn)CM以快速、靈活及定量等特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療的各個(gè)方面，尤其是與單克隆抗體技術(shù)的結(jié)合，使其在免疫分型、分選、免疫監(jiān)測(cè)、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面發(fā)揮了重要的作用，成為現(xiàn)代免疫學(xué)研究不可缺少的工具。該文對(duì)近年來流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；免疫學(xué)；檢測(cè)流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器1。FCM 可對(duì)細(xì)胞大小、細(xì)胞表面抗原的表達(dá)等進(jìn)行快速、靈活、定量、多參數(shù)的檢測(cè)，而且，可同時(shí)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸定量、DNA倍體、細(xì)胞周期分析， 細(xì)胞因子和黏附分子等2。具有分析速度快、精確度高、重復(fù)性好和費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。1流式細(xì)胞儀介紹1.1流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀主要由流動(dòng)室和液流系統(tǒng)，激光源和光學(xué)系統(tǒng)，光電管和檢測(cè)系統(tǒng)，計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng)5部分組成，其中，流動(dòng)室是儀器的核心部件。將待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，由氣壓裝置送入流動(dòng)室，以一定的流速經(jīng)過噴嘴進(jìn)入激光聚焦區(qū)，流速的選擇與檢測(cè)的目的有關(guān)，此時(shí)，在激光束的照射下，被熒光染色的細(xì)胞產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，其散射光信號(hào)和熒光信號(hào)經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)收集，由檢測(cè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成為電信號(hào)，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，各種信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)采集后，用相應(yīng)的應(yīng)用軟件進(jìn)行分析處理，最后，以直方圖或三維圖的形式顯示出來。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同的特征參數(shù)，從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類3。1.2流式細(xì)胞儀機(jī)型介紹近年，流式細(xì)胞儀的主要生產(chǎn)廠家有美國的BD (BectonDickinson)公司、貝克曼庫耳(Beckman Coulter)公司和德國的Partec公司。國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由前兩家生產(chǎn)。它們生產(chǎn)出一系列科研型和臨床型的流式細(xì)胞儀，并研制生產(chǎn)了流式細(xì)胞儀所用的各種單克隆抗體和熒光試劑。流式細(xì)胞儀可分為兩大類，一類為臨床分析型(又稱小型機(jī)、臺(tái)式機(jī))，其特點(diǎn)為儀器光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握，適合在臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。另一類為科研分選型(又稱綜合型)，特點(diǎn)為功能齊全，分析靈活，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來，同時(shí)可選配多種波長類型的激光器，適用于廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的制造工藝、功能、精確度等有了質(zhì)的飛躍。流式細(xì)胞儀已開始向模塊化發(fā)展，即它的光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元和電子系統(tǒng)都可以按照試驗(yàn)要求隨意更換4。各流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠商繼續(xù)推出新產(chǎn)品以滿足用戶的不同需要。如BD公司的FACSAria (高速細(xì)胞分選儀) 、分選增強(qiáng)型FACSVantage SETM (多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀)、LSR II(數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀)，F(xiàn)ACSCanto(雙激光六色分析流式細(xì)胞儀)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用單激光或雙激光激發(fā)方式，可進(jìn)行五色分析。Partec公司的頂級(jí)科研型十三色熒光流式細(xì)胞儀CYFLOW ML，臨床科研型六色熒光流式細(xì)胞儀DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流動(dòng)成像細(xì)胞儀)，將流式多色檢測(cè)技術(shù)和熒光顯微圖像顯示技術(shù)結(jié)合在一個(gè)平臺(tái)上，不僅可以通過熒光信號(hào)的強(qiáng)度，還可以通過細(xì)胞熒光圖像對(duì)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)定位，從而對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行定性和定量分析。2流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和免疫學(xué)研究的深入，流式細(xì)胞儀在分子免疫學(xué)、免疫生物學(xué)和免疫遺傳學(xué)，免疫血液學(xué)、免疫藥理學(xué)、移植免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、抗感染免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)等免疫學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科，以及淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞因子檢測(cè)等臨床研究中，也有了越來越廣泛的應(yīng)用。2.1淋巴細(xì)胞及其亞群分析FCM在臨床淋巴細(xì)胞及其亞群分析中得到廣泛應(yīng)用，可同時(shí)檢測(cè)出一種或幾種淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面抗原，將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，并計(jì)算出它們相互間的比例。通過淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量的檢測(cè)，可了解在不同情況下機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，輔助臨床疾病的診斷，探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案5。由于FCM可以進(jìn)行高靈敏度、高速度和多參數(shù)分析，使FCM對(duì)血液淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)較其他方法更精確，故其被認(rèn)為是血液淋巴細(xì)胞亞群分析的標(biāo)準(zhǔn)方法6。2.1.1檢測(cè)項(xiàng)目在臨床上，淋巴細(xì)胞及其亞群分析項(xiàng)目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；絕對(duì)計(jì)數(shù)(TruCount)；活化淋巴細(xì)胞的檢測(cè)(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4 Th/i和CD8Ts/c的進(jìn)一步區(qū)分；Naive/Memory T細(xì)胞亞群的檢測(cè)；Th1/Th2亞群的檢測(cè)。用流式細(xì)胞儀診斷某種疾病時(shí)，經(jīng)常需要檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目，如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機(jī)體免疫功能下降。檢測(cè)的免疫指標(biāo)表現(xiàn)為：T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少(正常值的65%81%)；T細(xì)胞亞群比值倒置，即Th/Ts1.0(正常1.3122.11)；Th細(xì)胞(CD4)絕對(duì)計(jì)數(shù)200個(gè)/L(正常值4001 500細(xì)胞/L)，CD8 T細(xì)胞在感染早期增多，后期則下降；Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；CD4/CD8 明顯低于健康成人(P0.01)。2.1.2檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展隨著新的熒光色素分子的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步和流式細(xì)胞儀的多激光激發(fā)技術(shù)的進(jìn)展，多色熒光分析得到迅速發(fā)展，三色、四色甚至五色或六色熒光分析對(duì)細(xì)胞亞群的識(shí)別、細(xì)胞功能評(píng)價(jià)等更為精確。近年，淋巴細(xì)胞及其亞群的分析已經(jīng)發(fā)展到三色熒光以上分析，且借用MultiSET全自動(dòng)獲取分析軟件完成。如：通過四色熒光標(biāo)記，對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群可進(jìn)行快速、客觀、準(zhǔn)確檢測(cè)及絕對(duì)計(jì)數(shù)分析78。利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T 細(xì)胞表面CD3 CD4 或CD8CD19CD16CD45ROCD62CD27 CD57 抗原，從而對(duì)LFA1adhesive T 細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測(cè)定9。總之，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)技術(shù)朝著多激光、多色分析方向發(fā)展。近年來，為了使樣本一次檢測(cè)，得到更多結(jié)果，滿足臨床多色分析診斷的需要，一些廠家為臨床應(yīng)用專門設(shè)計(jì)了六色分析流式細(xì)胞儀。2.2白血病免疫分型白血病是白細(xì)胞在分化到某個(gè)階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機(jī)制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型，對(duì)其進(jìn)行導(dǎo)向治療10。近年，白血病的MICM(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)，分子生物學(xué))分型已成為現(xiàn)代白血病診斷的重要指標(biāo)，其中應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型的檢測(cè)在分型中發(fā)揮了越來越重要的作用，現(xiàn)已積累了豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。它具有快速、客觀、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型具有極其重要的臨床診斷意義11。準(zhǔn)確的免疫分型關(guān)鍵是區(qū)分正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀白血病免疫分型依賴于白血病細(xì)胞的FSC/SSC特性來設(shè)定原始細(xì)胞群，然后根據(jù)門內(nèi)某些陽性單抗占門內(nèi)細(xì)胞的百分比來確定其抗原表達(dá)情況。很顯然，這種方法是不能將原始細(xì)胞與正常細(xì)胞完全分開的。隨著免疫學(xué)和遺傳學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，由開始的主要采用間接免疫熒光標(biāo)記法到直接免疫熒光標(biāo)記法，從單色或雙色到利用CD45抗體標(biāo)記設(shè)門法進(jìn)行多色免疫標(biāo)記。利用造血系統(tǒng)細(xì)胞CD45表達(dá)量與細(xì)胞分化程度的高度相關(guān)性，可以精確地將原始/幼稚細(xì)胞與正常成熟細(xì)胞群完全分開。使免疫分型的準(zhǔn)確性得到很大的提高，現(xiàn)在，已成為診斷白血病免疫分型的重要工具12。國際上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC設(shè)門法，并結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行免疫分型。如應(yīng)用流式細(xì)胞儀，采用CD45 SSC 設(shè)門法多參數(shù)，并利用抗體積分系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確地、完整地分析白血病免疫分型13。采用三色流式細(xì)胞術(shù)CD45/側(cè)散射(SSC) 雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門，并結(jié)合FAB 形態(tài)學(xué)能對(duì)急性白血病進(jìn)行準(zhǔn)確分型14。應(yīng)用流式細(xì)胞儀四色熒光標(biāo)記技術(shù)， CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法，能清楚地區(qū)分各種免疫細(xì)胞，可準(zhǔn)確、客觀地進(jìn)行白血病免疫分型15。2.3血小板膜表面受體檢測(cè)血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板膜上受體，主要是對(duì)血小板特異性膜糖蛋白和活化標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)合單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)，用不同的抗血小板單克隆抗體，可以從分子水平上診斷血小板功能和數(shù)量的異常。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定活化血小板是目前公認(rèn)的快捷而靈敏的方法之一16，可直接、靈敏、特異地分析血小板的活化程度和功能狀態(tài)。普遍采用的技術(shù)是以全血為標(biāo)本，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行多參數(shù)分析，即全血法流式細(xì)胞術(shù)。如采用流式細(xì)胞儀三色熒光標(biāo)記技術(shù)，能準(zhǔn)確地檢測(cè)冠心病患者血小板表面糖蛋白的變化17。采用流式細(xì)胞儀和三色免疫熒光標(biāo)記的單克隆抗體，可直接檢測(cè)全血樣本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表達(dá)水平18。與常規(guī)血小板功能測(cè)定法相比，全血法流式細(xì)胞術(shù)雖然有許多優(yōu)點(diǎn)，如直接使用全血樣本，且標(biāo)本用量少；簡(jiǎn)化標(biāo)本的處理，避免了樣本處理不當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致的血小板體外激活，并可防止血小板亞群的丟失，從而更客觀、更準(zhǔn)確地反映血小板的功能19。但是，全血法流式細(xì)胞術(shù)也存在不足之處，如流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，為了避免血小板體外活化，血樣不能久置，需在45 min內(nèi)處理；只能分析循環(huán)中的血小板的數(shù)量和功能，不能反映血小板代謝和最近被清除的血小板的數(shù)量。所以，還需對(duì)該方法進(jìn)行更深入的研究，并使之標(biāo)準(zhǔn)化20。2.4細(xì)胞因子的檢測(cè)細(xì)胞因子(cytokine)是由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽，在調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的生長、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)于闡明機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和臨床治療具有重要意義。隨著研究的進(jìn)展，僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量和活性的檢測(cè)已不能滿足需要。目前，越來越重視在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接免疫熒光法，可在單細(xì)胞水平上客觀、正確地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析，是一種有效地在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的方法21。近年主要采用的是胞內(nèi)流式分析法。該方法是基于BD公司的快速免疫細(xì)胞因子系統(tǒng)(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate， PMA)加離子霉素(ionomycin，Ion)作刺激劑， 刺激全血中淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)與莫能霉素(monensin，MN)等藥物阻斷細(xì)胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8設(shè)門，應(yīng)用兩種免疫熒光抗體同時(shí)標(biāo)記淋巴細(xì)胞膜表面特異分子和被阻滯在胞內(nèi)的細(xì)胞因子，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。該方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，如完善的全血激活方法，保留體內(nèi)細(xì)胞及生化微環(huán)境，能更準(zhǔn)確反映體內(nèi)狀況，避免了人工假象的產(chǎn)生。高效熒光結(jié)合抗體，確保高度靈敏及低背景染色。高質(zhì)量的膜通透劑，可以保證一致的靈敏度與低背景染色，且免除了為增加通透性所需冷凍細(xì)胞過夜的步驟。同型對(duì)照，避免了使用重組細(xì)胞因子進(jìn)行繁瑣的競(jìng)爭(zhēng)性封閉。該技術(shù)雖然已成為一項(xiàng)可在單細(xì)胞水平上檢測(cè)細(xì)胞因子的有效方法，尤其是在確定功能不同的T細(xì)胞亞群方面具有重要的作用22，具有其他方