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X射線晶體衍射分析【摘要】：本文介紹了晶體衍射分析的原理并對(duì)X射線在晶體衍射中的應(yīng)用及具體分析步驟進(jìn)行了闡述。X射線晶體衍射分析能解析蛋白質(zhì)晶體中原子在空間的位置與排列，迄今仍然是蛋白質(zhì)和核酸三維結(jié)構(gòu)測(cè)定的最主要方法，是精確測(cè)定蛋白質(zhì)分子中每個(gè)原子在三維空間位置的工具。【關(guān)鍵詞】：X射線 晶體 衍射81. 引言任何物質(zhì)均由原子離子或分子組成。晶體有別于非晶物質(zhì)，它的內(nèi)部所含原子離子或分子具有嚴(yán)格的三維有規(guī)則的周期性排列?？梢詮木w中取出一個(gè)基本單元，稱(chēng)為之晶胞。晶體的周期性結(jié)構(gòu)使晶體能對(duì)X射線中子流電子流等產(chǎn)生衍射效應(yīng)，形成X射線衍射法.中子流衍射法.電子流衍射法。這些衍射法能獲得有關(guān)晶體結(jié)構(gòu)可靠而精確的數(shù)據(jù)，其中最重要的是X射線晶體衍射法。1912年勞厄（M.von Laue）首先發(fā)現(xiàn)X射線可以被晶體衍射，開(kāi)創(chuàng)了晶體結(jié)構(gòu)分析的X射線衍射法。此后不久英國(guó)物理學(xué)家布拉格父子（W.H.Bragg和W.L.Bragg）在勞厄?qū)嶒?yàn)的基礎(chǔ)上，導(dǎo)出了一個(gè)比較直觀的X射線衍射方程式，從而為X射線衍射理論和技術(shù)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。X射線晶體衍射分析能解析蛋白質(zhì)晶體中原子在空間的位置與排列，迄今仍然是蛋白質(zhì)和核酸三維結(jié)構(gòu)測(cè)定的最主要方法，是精確測(cè)定蛋白質(zhì)分子中每個(gè)原子在三維空間位置的工具。2. X射線晶體衍射分析的發(fā)展史2.1 蛋白質(zhì)晶體的第一個(gè)X射線圖像時(shí)Bernal和Crowfoot于1934年測(cè)定的，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子含有豐富的結(jié)構(gòu)信息。2.2 1954年由Perrtz等人證明重原子同晶置換（heavy atom isomorphous replacement）可以解決相應(yīng)的問(wèn)題，又經(jīng)Blow和Crick加以發(fā)展，才解析了蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。2.3 在1957年和1959年Kerdrew和Perutz分別獲得了肌紅蛋白和血紅蛋白的低分辨率（0.6nm和0.5nm）結(jié)構(gòu)。2.4 在19571967年的10年里，溶菌酶、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶也分別獲得了高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。2.5 從20世紀(jì)60年代末進(jìn)入70年代，X射線晶體衍射分析從對(duì)生物大分子三維結(jié)構(gòu)測(cè)定進(jìn)入生物大分子三維結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能之間關(guān)系的研究。2.6 現(xiàn)在，生物大分子晶體學(xué)已被應(yīng)用到測(cè)定由許多生物大分子組成的極其復(fù)雜的大分子組裝體的晶體結(jié)構(gòu)。3. X射線衍射分析原理3.1 X射線的產(chǎn)生 1912年勞埃等人根據(jù)理論預(yù)見(jiàn)，并用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了X射線與晶體相遇時(shí)能發(fā)生衍射現(xiàn)象，證明了X射線具有電磁波的性質(zhì)，成為X射線衍射學(xué)的第一個(gè)里程碑。 3.2 X射線晶體衍射分析的理論依據(jù)X射線衍射分析是利用晶體形成的X射線衍射，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)部原子在空間分布狀況的結(jié)構(gòu)分析方法。將具有一定波長(zhǎng)的X射線照射到結(jié)晶性物質(zhì)上時(shí)，X射線因在結(jié)晶內(nèi)遇到規(guī)則排列的原子或離子而發(fā)生散射，散射的X射線在某些方向上相位得到加強(qiáng)，從而顯示與結(jié)晶結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的特有的衍射現(xiàn)象。衍射X射線滿足布拉格（W.L.Bragg）方程：2d sin=n式中：是X射線的波長(zhǎng)；是衍射角；d是結(jié)晶面間隔；n是整數(shù)。波長(zhǎng)可用已知的X射線衍射角測(cè)定，進(jìn)而求得面間隔，即結(jié)晶內(nèi)原子或離子的規(guī)則排列狀態(tài)。將求出的衍射X射線強(qiáng)度和面間隔與已知的表對(duì)照，即可確定試樣結(jié)晶的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，此即定性分析。從衍射X射線強(qiáng)度的比較，可進(jìn)行定量分析。本法的特點(diǎn)在于可以獲得元素存在 的化合物狀態(tài)、原子間相互結(jié)合的方式，從而可進(jìn)行價(jià)態(tài)分析，可用于對(duì)環(huán)境固體污染物的物相鑒定，如大氣顆粒物中的風(fēng)沙和土壤成分、工業(yè)排放的金屬及其化合物（粉塵）、汽車(chē)排氣中鹵化鉛的組成、水體沉積物或懸浮物中金屬存在的狀態(tài)等等。4. X射線晶體衍射分析步驟X 射線晶體衍射分析主要包括以下幾個(gè)步驟：4.1 蛋白質(zhì)單晶的制備制備蛋白質(zhì)單晶常用氣相擴(kuò)散法和平衡透析法氣相擴(kuò)散法。前者是蛋白質(zhì)晶中使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，小體積比較合適，容易建立且易于監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。通常的做法是“懸滴”，即在蛋白質(zhì)溶液中加入濃度不足以沉淀蛋白質(zhì)的“沉淀劑”。懸滴于一個(gè)大的含有沉淀劑的儲(chǔ)液槽相對(duì)，當(dāng)把儲(chǔ)液槽封閉后，平衡時(shí)懸滴液內(nèi)的蛋白質(zhì)傾向于過(guò)飽和濃度，從而引發(fā)懸滴液內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)晶。而平衡透析法，在具有高或低離子強(qiáng)度的蛋白質(zhì)結(jié)晶中使用。在容器中用半透膜隔開(kāi)小體積的蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑，沉淀劑慢慢促使隔間中的蛋白質(zhì)溶液形成晶體。結(jié)構(gòu)測(cè)定的精度依賴(lài)于晶體所能達(dá)到的衍射分辨率，所以獲得具有強(qiáng)衍射能力的晶體是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定分析的關(guān)鍵步驟，是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的難點(diǎn)。4.2 衍射數(shù)據(jù)收集和處理衍射數(shù)據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)，衍射數(shù)據(jù)的好壞直接關(guān)系到結(jié)果的精度。好的衍射數(shù)據(jù)于晶體的好壞、X射線源的強(qiáng)度以及收集數(shù)據(jù)的儀器和方法有關(guān)。蛋白質(zhì)晶體暴露于空氣中將解體，因?yàn)榫w中含水量相當(dāng)高（20%70%），在收集數(shù)據(jù)前要將晶體密封于一種特殊的毛細(xì)管中?，F(xiàn)在常使用低溫冷凍晶體的方法來(lái)收集數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)晶體快速冷凍魚(yú)液氮中，其結(jié)構(gòu)不受影響，且蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)降低，可以提供分辨率。對(duì)X射線衍射數(shù)據(jù)的收集和記錄裝置有兩大類(lèi)：一類(lèi)是使用對(duì)X射線敏感的照相底片或圖像板，另一類(lèi)是計(jì)數(shù)管或面探測(cè)儀。他們都具有一定的自動(dòng)化程度，但為了滿足結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的要求，還有待發(fā)展衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化裝置。4.3 相位確定和改進(jìn)相位確定是X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的核心。最基本的方法是同晶置換法，這是用于未知結(jié)構(gòu)分析的最有效方法，另外還有分子置換法、差值電子密度法，以及目前發(fā)展很快的多波長(zhǎng)反常散射法。晶胞的大小和形狀決定了晶體的衍射方向，反過(guò)來(lái)，通過(guò)衍射點(diǎn)的位置可以推算出晶胞參數(shù)和空間群，這叫做初步晶體學(xué)參數(shù)的測(cè)定。但晶胞中的原子種類(lèi)以及它在晶胞中的分布位置決定了衍射線強(qiáng)度，反過(guò)來(lái)，通過(guò)衍射線強(qiáng)度和一些方法，可以了解相位信息，從而通過(guò)富里哀加和獲得電子密度函數(shù)，獲得原子在晶胞中的分布位置，這就是晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定的目的和結(jié)果。由電子密度函數(shù)確定的電子密度圖得質(zhì)量及其后的可解釋性主要決定于相角的準(zhǔn)確性。在某些情況下采用晶胞不對(duì)稱(chēng)單元中等同部分的電子密度平均，有可能大大改善誤差較大的起始相角。4.4 電子密度圖的詮釋已知衍射線的結(jié)構(gòu)振幅（強(qiáng)度）和相位，通過(guò)富里哀加和就可能計(jì)算電子密度圖。電子密度圖時(shí)晶體結(jié)構(gòu)分析的直接結(jié)果，它包含了結(jié)構(gòu)的全部信息，如何從一套電子密度圖分析出這些信息，尚有一系列問(wèn)題需要解決。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)每一步都有誤差，最后所有的誤差都會(huì)表現(xiàn)在電子密度圖上，在解釋電子密度圖之前有一些方法和原則改善電子密度圖，稱(chēng)為電子密度圖的修飾。如溶劑平滑法（solvent flattering）、網(wǎng)格圖修飾法（histogram）。4.5 結(jié)構(gòu)模型精化通過(guò)電子密度圖分析獲得的結(jié)構(gòu)模型，還需要進(jìn)行原子坐標(biāo)的精化，結(jié)構(gòu)精化主要使用的是限制性最小二乘修正。目前已經(jīng)有一些全自動(dòng)化的分析軟件用于結(jié)構(gòu)修正，如：PROLSQ、XPLOR、TNT、CNS、BUSTER、REFMAC等。最后用實(shí)體模型或模型顯示系統(tǒng)將蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)顯示出來(lái)。5. X射線在晶體衍射分析中的應(yīng)用X射線在結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用非常廣泛，現(xiàn)已滲透到物理、化學(xué)、礦物學(xué)、冶金學(xué)、地球科學(xué)和生命科學(xué)以及各種工程技術(shù)科學(xué)之內(nèi)，成為一種重要的手段和分析方法，提供系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)信息。5.1 物相分析衍射圖晶體的射線衍射圖像實(shí)質(zhì)上是晶體微觀結(jié)構(gòu)的一種精細(xì)復(fù)雜的變換，每種晶體的結(jié)構(gòu)與其射線衍射圖之間都有著一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，其特征X射線衍射圖譜不會(huì)因?yàn)樗N物質(zhì)混聚在一起而產(chǎn)生變化，這就是射線衍射物相分析方法的依據(jù)。制備各種標(biāo)準(zhǔn)單相物質(zhì)的衍射花樣并使之規(guī)范化，將待分析物質(zhì)的衍射花樣與之對(duì)照，從而確定物質(zhì)的組成相，就成為物相定性分析的基本方法。鑒定出各個(gè)相后，根據(jù)各相花樣的強(qiáng)度正比于改組分存在的量（需要做吸收校正者除外），就可對(duì)各種組分進(jìn)行定量分析。目前常用衍射儀法得到衍射圖譜，用“粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)（JCPDS）”負(fù)責(zé)編輯出版的“粉末衍射卡片（PDF卡片）”進(jìn)行物相分析。5.2 點(diǎn)陣常數(shù)的精確測(cè)定點(diǎn)陣常數(shù)是晶體物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)參數(shù)，測(cè)定點(diǎn)陣常數(shù)在研究固態(tài)相變、確定固溶體類(lèi)型、測(cè)定固溶體溶解度曲線、測(cè)定熱膨脹系數(shù)等方面都得到了應(yīng)用。點(diǎn)陣常數(shù)的測(cè)定是通過(guò)X射線衍射線的位置（ ）的測(cè)定而獲得的，通過(guò)測(cè)定衍射花樣中每一條衍射線的位置均可得出一個(gè)點(diǎn)陣常數(shù)值。5.3 應(yīng)力的測(cè)定X射線測(cè)定應(yīng)力以衍射花樣特征的變化作為應(yīng)變的量度。宏觀應(yīng)力均勻分布在物體中較大范圍內(nèi)，產(chǎn)生的均勻應(yīng)變表現(xiàn)為該范圍內(nèi)方向相同的各晶粒中同名晶面間距變化相同，導(dǎo)致衍射線向某方向位移，這就是X射線測(cè)量宏觀應(yīng)力的基礎(chǔ)；微觀應(yīng)力在各晶粒間甚至一個(gè)晶粒內(nèi)各部分間彼此不同，產(chǎn)生的不均勻應(yīng)變表現(xiàn)為某些區(qū)域晶面間距增加、某些區(qū)域晶面間距減少，結(jié)果使衍射線向不同方向位移，使其衍射線漫散寬化，這是X射線測(cè)量微觀應(yīng)力的基礎(chǔ)。超微觀應(yīng)力在應(yīng)變區(qū)內(nèi)使原子偏離平衡位置，導(dǎo)致衍射線強(qiáng)度減弱，故可以通過(guò)X射線強(qiáng)度的變化測(cè)定超微觀應(yīng)力。測(cè)定應(yīng)力一般用衍射儀法。5.4 晶粒尺寸和點(diǎn)陣畸變的測(cè)定若多晶材料的晶粒無(wú)畸變、足夠大，理論上其粉末衍射花樣的譜線應(yīng)特別鋒利，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，這種譜線無(wú)法看到。這是因?yàn)閮x器因素和物理因素等的綜合影響，使純衍射譜線增寬了。純譜線的形狀和寬度由試樣的平均晶粒尺寸、尺寸分布以及晶體點(diǎn)陣中的主要缺陷決定，故對(duì)線形作適當(dāng)分析，原則上可以得到上述影響因素的性質(zhì)和尺度等方面的信息。主要方法有傅里葉法、線形方差法和積分寬度法。5.5 單晶取向和多晶織構(gòu)測(cè)定單晶取向的測(cè)定就是找出晶體樣品中晶體學(xué)取向與樣品外坐標(biāo)系的位向關(guān)系。雖然可以用光學(xué)方法等物理方法確定單晶取向，但X衍射法不僅可以精確地單晶定向，同時(shí)還能得到晶體內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的信息。一般用勞埃法單晶定向，其根據(jù)是底片上勞埃斑點(diǎn)轉(zhuǎn)換的極射赤面投影與樣品外坐標(biāo)軸的極射赤面投影之間的位置關(guān)系。透射勞埃法只適用于厚度小且吸收系數(shù)小的樣品；背射勞埃法就無(wú)需特別制備樣品，樣品厚度大小等也不受限制，因而多用此方法 。多晶材料中晶粒取向沿一定方位偏聚的現(xiàn)象稱(chēng)為織構(gòu)，常見(jiàn)的織構(gòu)有絲織構(gòu)和板織構(gòu)兩種類(lèi)型。為反映織構(gòu)的概貌和確定織構(gòu)指數(shù)，有三種方法描述織構(gòu)：極圖、反極圖和三維取向函數(shù)，這三種方法適用于不同的情況。對(duì)于絲織構(gòu)，要知道其極圖形式，只要求出求其絲軸指數(shù)即可，照相法和衍射儀法是可用的方法。板織構(gòu)的極點(diǎn)分布比較復(fù)雜，需要兩個(gè)指數(shù)來(lái)表示，且多用衍射儀進(jìn)行測(cè)定 。6X射線晶體衍射分析的發(fā)展近些年，蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)無(wú)論從結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法，還是從結(jié)構(gòu)測(cè)定所用的儀器上都有了飛躍的發(fā)展?？勺儾ㄩL(zhǎng)的同步輻射加速器的應(yīng)用使高分辨率、高質(zhì)量的衍射數(shù)據(jù)的獲得變得較為容易。低溫技術(shù)的廣泛應(yīng)用使冷凍后的蛋白質(zhì)晶體在衍射過(guò)程中所受的輻射損害大為減少，從而減低了對(duì)晶體的要求并提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量。各種形式的面探測(cè)器和CCD的出現(xiàn)大幅度提高了數(shù)據(jù)收集速度和精度。而各種計(jì)算機(jī)硬件和軟件的發(fā)展更為晶體學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力到了計(jì)算工具。如今，在相當(dāng)程度上，蛋白質(zhì)晶體學(xué)已成為一種常規(guī)的技術(shù)手段，它可在原子或接近原子的水平上分析蛋白質(zhì)的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。另外，X射線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析正努力在第四維時(shí)間坐標(biāo)上跟蹤、分辨和描述生物大分子的結(jié)構(gòu)變化，即所謂四維晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定。由于同步輻射所提供的X射線光源可以達(dá)到很高強(qiáng)度，因而可以在一秒計(jì)的時(shí)間范圍收集一套完整的衍射數(shù)據(jù)，使得在以秒計(jì)的時(shí)間范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)測(cè)定成為可能。參考文獻(xiàn)【1】顏真，張英起. X射線晶體衍射法J .蛋白質(zhì)研究技術(shù)，2006, 9（第四版）：166-171.【2】王浩，廖常俊，范廣涵. X射線晶體衍射技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用J .大學(xué)物理，2001,20（7）: 30-35 .【3】 胡林彥. X射線衍射分析的實(shí)驗(yàn)方法及其應(yīng)用J .河北理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2004,26（3）: 84-90 .【4】Smyth MS, Martin JH. X- ray crystallography. Mol Pathol, 2000 Feb, 53 (1) :8-14.【5】Abola E, Kuhn P, Earnest T, Stevens RC . Automation of X-ray crystallography.Nat Struct Biol, 2000, 7 S