bi1短發(fā)夾狀RNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒對鼻咽癌和卵巢癌細(xì)胞增殖的影響.doc

bi1短發(fā)夾狀RNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒對鼻咽癌和卵巢癌細(xì)胞增殖的影響作者：張美紅單位：廣東湛江, 廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所【摘要】 目的 以真核表達(dá)質(zhì)粒pmU6為基礎(chǔ)，針對bi1基因構(gòu)建在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾狀 RNA (shRNA) 的質(zhì)粒載體，并觀察它們對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細(xì)胞株生長增殖的影響。方法 人工合成bi1寡核苷酸鏈，退火、定向克隆入pmU6載體中產(chǎn)生重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，MTT比色法觀察轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒載體對細(xì)胞生長增殖的影響。結(jié)果 與未處理組相比，bi1shRNA對CNE2Z、CNE1、HO8910PM細(xì)胞株的生長增殖有明顯的抑制作用，而對HO8910細(xì)胞株的生長增殖無明顯抑制作用。結(jié)論 重組質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNA，產(chǎn)生RNA干擾(RNA interference, RNAi)效應(yīng)并特異性抑制靶細(xì)胞的生長增殖，為質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)應(yīng)用于鼻咽癌和卵巢癌的基因治療提供一定的理論依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】 RNAi 基因轉(zhuǎn)染 bi1 RNAi 指在生物體細(xì)胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA (doublestranded RNA, dsRNA)啟動并介導(dǎo)與其同源mRNA的特異性降解，從而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程1。在RNAi過程中，細(xì)胞內(nèi)小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的來源有不同的形式，以siRNA表達(dá)載體(質(zhì)粒或病毒載體)法的應(yīng)用最為廣泛。本研究以真核表達(dá)質(zhì)粒pmU6為基礎(chǔ)，針對bi1基因的5個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，以期在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA，并觀察bi1shRNA表達(dá)質(zhì)粒在兩種腫瘤細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)對靶細(xì)胞生長增殖的影響。 1 材料和方法 1.1 菌株、細(xì)胞株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α自衛(wèi)生部武漢生物制品研究所引進(jìn)；鼻咽癌低分化上皮細(xì)胞株CNE2Z、鼻咽癌高分化上皮細(xì)胞株CNE1、高轉(zhuǎn)移卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株HO8910PM細(xì)胞株、卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株HO8910自上海細(xì)胞生物所引進(jìn)；pmU6質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建并保存2。 1.2 試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基和小牛血清購于美國Gibco公司；脂質(zhì)體(Lipofectmine TM2000)購于Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；工具酶購于新英格蘭生物公司(NEB)和華美生物工程公司；四氮唑藍(lán)(MTT)購于SinoAmerican Biotechnology公司；酶標(biāo)儀為美國BioRad公司產(chǎn)品；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。 1.3 表達(dá)bi1shRNA載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)Reynolds等3的原則進(jìn)行siRNA序列的設(shè)計(jì)，從人bi1基因 (gi:23271 944)序列中選擇Position: 212238、Position: 350376、Position: 573599、Position: 735761四個(gè)位點(diǎn) (因bi1的CDS為141854)，分別命名為bi11、bi12、bi13、bi14，相應(yīng)的重組質(zhì)粒命名為pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6 bi14；同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)陰性對照siRNA序列，命名為bi1s，相應(yīng)的重組質(zhì)粒命名pmU6bi1s。候選bi1 siRNA序列需要經(jīng)過GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST分析。siRNA序列只列出正鏈序列：bi11 (27nt)正義鏈：5′GCAGCACCTGAAGAAGGTCTATGCAAG3′；bi12 (27nt)正義鏈：5′GCTGATGGCAACACCTCATAGCCATGA3′；bi13(27nt) 正義鏈：5′GGTATCTTGATGTCAGCCCTGAGCTTG3′；bi14 (27nt) 正義鏈：5′GGAGATCAAGATTATATCTGGCACTGC3′；bi1s (27nt) 正義鏈：5′GGTATCTTGATGTGCCACCTGAGCTTG3′。表達(dá)shRNA的轉(zhuǎn)錄模板是由9bp的連接片段將siRNA序列的正義鏈(27nt)和反義鏈(27nt)連接而成的反向重復(fù)序列，5對shRNA轉(zhuǎn)錄模板序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 將各shRNA轉(zhuǎn)錄模板退火后，與Bbs酶切后的pmU6大片段進(jìn)行定向重組，然后轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆。小量提取陽性克隆菌質(zhì)粒DNA后直接進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；另各取1μg質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pmU6上游引物：5′CGACACGGAAATGTTGAA3′；pmU6下游引物：5′AGGGAAGAAAGCGAAAGGA3′。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94 3min，94 40s、52 90s、72 1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定正確的陽性克隆菌進(jìn)行測序鑒定。 1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細(xì)胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按照轉(zhuǎn)染試劑操作手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)4。 1.5 MTT比色法檢測細(xì)胞的生長抑制率 實(shí)驗(yàn)設(shè)未處理組、Lip (脂質(zhì)體)組、pmU6質(zhì)粒對照組、各重組干擾質(zhì)粒組。各組的質(zhì)粒濃度為2mg/L(0.2μg/孔)；Lip組按轉(zhuǎn)染相應(yīng)濃度質(zhì)粒所需用量設(shè)計(jì)其終濃度。轉(zhuǎn)染48h后，每孔加入10g/L MTT 10μl，培養(yǎng)4h后，加二甲基亞砜100μl，測定波長570nm和630nm處的吸光度A值。每組設(shè)4個(gè)平行孔，結(jié)果取平均值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：抑制率(%) = (1實(shí)驗(yàn)孔A值/對照孔A值)×100 %。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。P>0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 表達(dá)bi1 shRNA重組質(zhì)粒的鑒定 將提取的質(zhì)粒進(jìn)行1%普通瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。電泳結(jié)果與理論值 (質(zhì)粒pmU6為4 856bp，質(zhì)粒pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6bi14和pmU6bi1s均為4 614bp)相符。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖2。各重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為752bp，而質(zhì)粒pmU6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為994bp，電泳結(jié)果與理論值相符。 2.2 各重組質(zhì)粒表達(dá)的bi1 shRNA對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細(xì)胞生長增殖的影響 為了觀察針對bi1設(shè)計(jì)的siRNA序列對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細(xì)胞株的抑制效率，我們用上述重組質(zhì)粒對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，MTT結(jié)果見表14。表1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒對CNE2Z細(xì)胞生長抑制作用3 討論 RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的同源mRNA特異性降解現(xiàn)象。目前RNAi作為一種新的反向遺傳學(xué)手段引起了人們的廣泛關(guān)注，自2001年Tuschl首先成功地將RNAi技術(shù)用于哺乳動物細(xì)胞起5，RNAi不但被應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的基因功能分析，還被廣泛用于腫瘤的基因治療。 本文所選擇的靶基因bi1是近年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，不屬于與程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)有關(guān)的任何基因家族，是少數(shù)幾種同時(shí)存在于動物和植物中的保守性細(xì)胞死亡抑制因子之一；在動物中，bi1是受bcl2和bax調(diào)控的細(xì)胞死亡通路上的新型調(diào)節(jié)因子。與相應(yīng)的正常細(xì)胞相比，bi1在前列腺癌6、原發(fā)性乳腺癌7, 8細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)4倍到10倍；另外，在子宮癌、卵巢癌和肺腺癌細(xì)胞9中也發(fā)現(xiàn)bi1基因表達(dá)的上調(diào)，這些表明，bi1基因的過表達(dá)可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。運(yùn)用RNAi技術(shù)阻抑bi1基因在人前列腺癌、原發(fā)性乳腺癌中的表達(dá), 已獲得了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的滿意結(jié)果，故bi1有望成為這些腫瘤潛在的預(yù)后標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道8，bi1在某些腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不依賴于腫瘤細(xì)胞的分化程度。據(jù)已檢索到的文獻(xiàn)，迄今國內(nèi)尚無通過阻抑bi1基因表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究報(bào)道，故本研究選擇具有不同分化程度的鼻咽癌細(xì)胞和具有不同轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行初步的研究。 本研究構(gòu)建的質(zhì)粒載體可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對bi1的shRNA，shRNA在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下可迅速形成siRNA10，故可觀察它們在不同腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的RNAi效應(yīng)對細(xì)胞生長增殖的影響。在mU6啟動子作用下，重組質(zhì)粒所表達(dá)的shRNA如圖3(只列出pmU6bi11重組質(zhì)粒表達(dá)的shRNA，其他類似)。 本課題組經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNE2Z和CNE1細(xì)胞中均有bi1基因的表達(dá)且表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。把表達(dá)bi1 shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CNE2Z、CNE1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)針對bi1的不同siRNA序列對CNE2Z、CNE1細(xì)胞生長增殖均有較強(qiáng)的抑制作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，通過阻抑bi1基因表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞生長增殖的影響并不依賴于鼻咽癌細(xì)胞的分化程度，故初步推測：利用RNAi技術(shù)阻抑bi1基因表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞生長增殖進(jìn)而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的過程中，CNE2Z和CNE1細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能是相同或相似的，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。 本課題組經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HO8910PM和HO8910細(xì)胞中也有bi1基因的表達(dá)且表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)轉(zhuǎn)染表達(dá)bi1 shRNA的干擾質(zhì)粒至HO8910PM 和HO8910細(xì)胞中時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們對HO8910PM的生長增殖均有較強(qiáng)抑制作用，而對HO8910細(xì)胞的生長增殖無明顯抑制作用。腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分裂與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)，一些基因及其產(chǎn)物如p53、p21、Cyclin D1、PCNA 等是細(xì)胞周期調(diào)控中重要的調(diào)控因子11。由于HO8910PM和HO8910細(xì)胞在癌基因和抑癌基因、轉(zhuǎn)移基因和抑轉(zhuǎn)移基因、凋亡基因和存活基因等的表達(dá)上存在差異12： HO8910PM細(xì)胞中，p21、Cyclin D1、CD44V6、凋亡連接基因2(ALG2)13、突變型p53、EGFR等的表達(dá)強(qiáng)度大于HO8910細(xì)胞； HO8910PM細(xì)胞中，nm23、p16的表達(dá)強(qiáng)度弱于HO8910細(xì)胞，所以，這兩株細(xì)胞在生長、增殖等過程中具有各自的生物學(xué)特征。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與，經(jīng)過多階段協(xié)同作用的結(jié)果，某一基因的變化僅僅影響腫瘤一定階段的某些生物學(xué)特征。本文通過阻抑bi1一個(gè)基因表達(dá)，觀察到對HO8910PM和HO8910細(xì)胞生長增殖影響的差異，可能與這兩株具有不同轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞中蛋白表達(dá)存在明顯差異有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步地研究與探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Mccaffrey AP, Meuse L, Pham TT, et al. 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