分子實驗——影響PCR擴增因素的分析.doc

影響PCR擴增因素的分析【摘要】聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)問世以來，已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)得到了巨大的發(fā)展并不斷完善，不僅廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，在疾病診斷等方面也有了越來越廣泛深入的研究和應(yīng)用。該反應(yīng)具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點,經(jīng)過不斷改良，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究常用的手段。通過閱讀大量文獻資料，本文對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本概念、工作原理以及影響其擴增的因素各方面作了概述?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 溫度 引物 Taq DNA聚合酶前言:DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實驗發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR，又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，其最基本的3個環(huán)節(jié)是:DNA變性：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。 退火（復(fù)性）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 延伸：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。由以上三個環(huán)節(jié)組成一個周期，循環(huán)進行，每一循環(huán)，DNA含量增加一倍，此方法操作簡便快速，并且非常有效，可在很短的時間內(nèi)得到數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的地方。目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，如將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。1.引物要擴增模板DNA，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5端決定擴增產(chǎn)物的兩個5末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為2024個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72）下不會形成穩(wěn)定的雜合體。有時可在5端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測等各種目的。 引物擴增跨度以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴增片段（G+C）%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%60%為佳，+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補。特別是在引物3端，即使無法避免，其3端互補堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer）。所謂引物二聚體實質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時甚至成為主要產(chǎn)物。 引物3端配對DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以引物3端56個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴增。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結(jié)合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。2.酶及其濃度早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶純品。DNA聚合酶是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性，并有35外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個片段分子量為34000，具有53外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有35外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是53外切酶活力，它能從5端水解核苷酸，還能經(jīng)過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成-珠蛋白的PCR后，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。PCR反應(yīng)中最常用的DNA聚合酶即Taq DNA聚合酶。用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級結(jié)構(gòu)對PCR的干擾，增進了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度。二者相比，其主要區(qū)別在于：Klenow酶的最適溫度為37，擴增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為7475。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯配引物的延伸。循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個（均用1g基因組DNA開始）而Taq酶為30個。延伸片段長度Taq酶為10kb以內(nèi)，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3.dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。4.模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。5.Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。6.溫度與時間的設(shè)置在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如通常操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：9460s, 3760s, 72120s，共2530個循環(huán)，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要3060s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器均應(yīng)進行實測。關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的。變性溫度與時間變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取9095。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95。退火(復(fù)性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進行推測，一般試驗中退火溫度Ta (annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5，可按公式進行計算： Ta = Tm - 5= 4(G+C)+ 2(A+T) -5 其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時，則Ta的起點可設(shè)在55。在典型的引物濃度時（如0.2mol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時間引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于90時，DNA合成幾乎不能進行 PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，在72時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達35100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴增10Kb 需延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。7.循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在2540次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。但實驗過程中，一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。擴增結(jié)束后，樣品冷卻并置4保存。參考文獻1 朱玉賢，李毅編著. 現(xiàn)代分子生物學(xué)，第3版，北京：高等教育出版社，2007.112 魏