DNA的提取與鑒定講解.ppt

專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題1 DNA的粗提取和鑒定 討論2 如何證明他們是遺傳物質(zhì) 討論3 怎樣才能將細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)分離出來(lái) 討論1 構(gòu)成生物體的遺傳物質(zhì)是什么 1 提取生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子 2 生物大分子主要指蛋白質(zhì) 酶和核酸 3 提取DNA的基本思路利用DNA與RNA 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異 提取DNA 去除其他成分 基礎(chǔ)知識(shí) 提取DNA的方法 4 DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同 利用這一特點(diǎn) 選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解 而使雜質(zhì)沉淀 或者相反 根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖 思考在什么濃度下 DNA的溶解度最小 DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的 在NaCl溶液濃度低于0 14mol L時(shí) DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低 在0 14mol L時(shí) DNA溶解度最小 當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí) DNA的溶解度又逐漸增大 如何通過(guò)控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出 當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol L時(shí) DNA的溶解度最大 濃度為0 14mol L時(shí) DNA的溶解度最低 利用這一原理 可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出 6 DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液 但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精 利用這一原理 可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離 7 DNA對(duì)酶 高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì) 但是對(duì)DNA沒(méi)有影響 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60 80 C的高溫 而DNA在80 C以上才會(huì)變性 洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜 去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì) 但對(duì)DNA沒(méi)有影響 8 DNA的鑒定 DNA與二苯胺 沸水浴 會(huì)染成藍(lán)色 因此 二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑 甲基綠 藍(lán)綠色 一 實(shí)驗(yàn)材料的選取 1 材料 魚(yú)卵 豬肝 菜花 香蕉 雞血 哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞 獼猴桃 洋蔥 豌豆 菠菜 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌 從中選取2 3種實(shí)驗(yàn)材料 2 原則 凡是含有DNA的生物材料都可以考慮 但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織 成功的可能性更大 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 二 破碎細(xì)胞 獲取含DNA的濾液 1 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易 例如 在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 同時(shí)用玻璃棒攪拌 過(guò)濾后收集濾液即可 答 蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi) 使血細(xì)胞脹裂 再加上攪拌的機(jī)械作用 就加速了雞血細(xì)胞的破裂 細(xì)胞膜和核膜的破裂 從而釋放出DNA 討論 為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂 2 植物細(xì)胞 植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜 討論 加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么 答 洗滌劑是一些離子去污劑 能溶解細(xì)胞膜 有利于DNA的釋放 食鹽的主要成分是NaCl 有利于DNA的溶解 實(shí)例 提取洋蔥DNA時(shí) 在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽 進(jìn)行充分的攪拌和研磨 過(guò)濾后收集研磨液 討論 如果研磨不充分 會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響 答 研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全 提取的DNA量變少 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物 用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等 三 去除濾液中的雜質(zhì) 為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理 討論 此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分 答 可能含有核蛋白 多糖和RNA等雜質(zhì) 答 用高鹽濃度的溶液溶解DNA 能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) 用低鹽濃度使DNA析出 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) 因此 通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA 就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì) 答 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白 從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi) 方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同 從而使蛋白質(zhì)變性 與DNA分離 四 DNA的析出與鑒定 1 DNA的析出DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液 體積分?jǐn)?shù)為95 靜置2 3min 溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物 這就是粗提取DNA 用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌 卷起絲狀物 并用濾紙吸取上面的水 2 DNA的鑒定鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol L的NaCl溶液5ml于兩只試管中 其中一只加入DNA絲狀物 各加入二苯胺4ml試劑 混合均勻后 將試管置于沸水中加熱5min 待試管冷卻后 比較兩只試管中溶液顏色的變化 看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色 操作提示 1 以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí) 每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉 防止血液凝固 2 加入洗滌劑后 動(dòng)作要輕緩 柔和 否則容易產(chǎn)生大量的泡沫 不利于后續(xù)步驟的操作 加入酒精和玻璃棒攪拌時(shí) 動(dòng)作要輕緩 以免加劇DNA分子的斷裂 導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀 3 二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用 否則會(huì)影響鑒定的效果 二苯胺試劑的配制稱取1 5g二苯胺 溶于100ml冰醋酸中 再加入1 5ml濃硫酸 用棕色瓶保存 臨用前 在10ml的上述溶液中再加入0 1ml體積分?jǐn)?shù)為0 2 的乙醛溶液 1 制雞血細(xì)胞液 活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得 500mL燒杯中 玻棒攪拌 離心 分離或靜置沉淀 2 提取DNA 取血細(xì)胞5 10mL 20mL蒸餾水 用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌 紗布過(guò)濾 濾液中含DNA和其他核物質(zhì) 如蛋白質(zhì) 提取血細(xì)胞核物質(zhì) 溶解核內(nèi)的DNA 濾液 2mol L的NaCl溶液40mL 玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌 三 實(shí)驗(yàn)步驟 析出含DNA的粘稠物 濾取含DNA的粘稠物 DNA粘稠物的再溶解 在上述溶液中緩緩加入蒸餾水 并沿一個(gè)方向輕輕攪拌 出現(xiàn)絲狀物 當(dāng)絲狀物不在增加時(shí) 停止加水 此時(shí)NaCl溶液的濃度相當(dāng)于0 14mol L 用多層紗布過(guò)濾 含DNA的粘稠物留在紗布上 在20mL燒杯中輕緩攪拌3min 使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液 過(guò)濾含有DNA的NaCl溶液 用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟 所得的溶液 濾液中含有DNA 提取含有雜質(zhì)較少的DNA 步驟 所得的濾液 體積分?jǐn)?shù)為95 的冷卻酒精50mL 用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌 溶液中 析出 出現(xiàn)乳白色絲狀物 用玻棒將絲狀物卷起 并用濾紙吸取上面的水分 3 DNA的鑒定 加入二苯胺試劑4mL 用玻棒攪拌使DNA溶解 沸水浴5min 觀察溶液是否出現(xiàn)淺藍(lán)色 1 共有 三次過(guò)濾 兩次析出 七次攪拌 2 加入 兩次蒸餾水 三次NaCl溶液 一次酒精 三 實(shí)驗(yàn)小結(jié) 四 實(shí)驗(yàn)原理拓展介紹 1 DNA的釋放 DNA主要在雞血細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi) 正常情況下不會(huì)釋放出來(lái) 蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞是一種低滲液 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞 使之脹破 同時(shí)加上玻璃棒快速攪拌的機(jī)械作用 加速血細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜的破裂 但釋放出來(lái)的大量DNA與RNA 蛋白質(zhì)結(jié)合在一起 即釋放的不是純凈的DNA 常稱為DNA核蛋白 2 DNA與蛋白質(zhì)分離 在高濃度 2mol L 的氯化鈉溶液中 核蛋白易溶解 析出DNA并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中 3 DNA的析出與獲取 因?yàn)镈NA在低濃度 0 14mol L 的氯化鈉溶液中溶解度小 而蛋白質(zhì)的在其中的溶解度大 所以在向含DNA的高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液 從而使DNA溶解度下降 蛋白質(zhì)溶解度增高 4 DNA的再溶解 用高濃度 2mol L 的氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物 5 DNA的沉淀和濃縮 對(duì)于除去了蛋白質(zhì)的DNA的氯化鈉溶液 必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮 常用酒精沉淀法 即往含有Na 的DNA溶液 加入體積分?jǐn)?shù)為95 的冷卻酒精 混勻后可以使DNA沉淀 濃縮 形成含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物 懸浮于溶液中 若絲狀物較少 可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可 濃縮后的DNA絲狀物可以用玻棒 玻棒有吸附DNA的作用 緩緩旋轉(zhuǎn)的方法卷起 6 DNA的鑒定 鑒定時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān) 加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固 加速血細(xì)胞破裂 溶解DNA 使2mol L的NaCl溶液稀釋至0 14mol L使得DNA最大限度地釋出 使含DNA的黏稠物被留在紗布上 使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中 除去含DNA的濾液中的雜質(zhì) 提取DNA A出現(xiàn)藍(lán)色B無(wú)變化 課題延伸 本課題使用的洗滌劑是多組分的混合物 在嚴(yán)格的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中很少使用 實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA時(shí) 通常使用十六烷基三甲基溴化銨 CTAB 十二烷基硫酸鈉 SDS 或吐溫等化學(xué)試劑 2 實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol L和0 14mol L對(duì)DNA有何影響 1 在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是 A 稀釋血液 沖洗樣品B 使血細(xì)胞破裂 降低NaCl濃度使DNA析出C 使血細(xì)胞破裂 增大DNA溶解量D 使血細(xì)胞破裂 提取含雜質(zhì)較少的DNA 答 B 答 前者是溶解DNA 后者是使DNA析出 3 DNA遇二苯胺 沸水浴 會(huì)染成 A 磚紅色B 橘黃色C 紫色D 藍(lán)色 4 提取雞血中的DNA時(shí) 為什么要除去血液中的上清液 答 DNA的提取 關(guān)鍵是對(duì)雜質(zhì)的去除 由于上清液是血液中的血漿部分 不含DNA 所以要除去上清液 含有蛋白質(zhì) 答 D 5 關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇 也經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較 最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么 請(qǐng)回答下列問(wèn)題 1 雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞含有細(xì)胞核 家雞屬