殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ枘┲胁瓒喾拥奈叫阅苎芯慨厴I(yè)論文

殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ枘┲胁瓒喾拥奈叫阅苎芯扛＝◣煼洞髮W福清分校海洋與生化工程學院 應用化學專業(yè)118652012008 劉飛翔 指導老師 薛麗群摘 要本文研究了殼聚糖-聚丙烯對茶末中茶多酚吸附分離條件，并采用HPLC分析吸附分離效果。該實驗結(jié)果表明對25.00mL茶湯（質(zhì)量濃度為0.985mg/mL），較好的吸附條件為殼聚糖-聚丙烯酸微球加入量0.3g、吸附時間為2h、茶湯pH為7.00、溫度30時，震蕩速率110r/min，茶多酚的吸附率可達到73.20 %。關(guān)鍵詞殼聚糖-聚丙烯酸微球；吸附；綠茶；茶多酚1前言茶多酚( tea-polyphenols, 簡稱TP)作為茶葉中一類主要成分具有獨特的藥理作用，具有抗氧化性、能預防癌變、腫瘤、心腦血管疾病等癥狀，在醫(yī)學上有極好的前景。它在茶葉中含量很高，性質(zhì)相當活潑，能在酶的作用下，發(fā)生酶促氧化，也能在濕熱的作用下發(fā)生氧化作用，還能在常溫常壓下發(fā)生緩慢氧化1 。茶多酚主要成分為兒茶素類化合物（黃烷醇類）、黃酮及黃酮醇類、花色素類和酚酸及縮酚酸類多酚化合物的復合體，其中兒茶素類屬黃烷醇類，約占茶多酚總量的80%，主要包括：表沒食子兒茶素沒食子酸酯( EGCG) 、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）、兒茶素（C）、沒食子酸（GA）2。自古以來中國是產(chǎn)茶大國. 明朝李時珍在本草綱目中記載說: “茶苦而寒, 最能降火, 火為百病之因, 火降則百病清也”. 茶由古代的藥到后來的飲料, 現(xiàn)在又回歸到藥, 是現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學科技的成果. 茶多酚是從綠茶中提取出來的最主要、最精華、對人體最有益的成分, 是由茶葉中的黃烷醇類、黃酮、黃酮醇類、花青素類、茶白素類和酚酸及縮酚酸類組成的化合物, 主要成分是黃烷-3-醇衍生物, 俗稱兒茶素. 它們的結(jié)構(gòu)除酚及縮合酚類外, 均具有a-苯基苯駢二氫吡喃( 黃烷) 為主體的C6-C3-C6 基本碳架. 所以“其結(jié)構(gòu)決定了茶多酚的性質(zhì)及其作用”3。茶葉資源非常豐富，主要加工產(chǎn)品為茶葉，但在茶葉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量茶末和滯銷的粗老茶，目前在中國，沒有什么利用價值，幾乎是都當作廢料處理了。因此開展茶多酚提取和其生物學活性的研究，研發(fā)出能防治防癌變、腫瘤、心腦血管疾病等一系列具有醫(yī)療保健效果的飲料、食品、化妝品、藥品，不僅為保障人民健康作出貢獻，而且還可以創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟效益4。目前茶多酚的提取方法有：溶劑提取法、金屬離子沉淀法、樹脂吸附法、超臨界流體萃取法、超聲波浸提法等方法5。但是由于茶多酚本身不穩(wěn)定，容易被氧化等各種原因使溶劑提取法過程中茶多酚損失較多。有研究表明 6-8 ，采用乙醇、氯仿等作為提取溶劑，可以延緩茶多酚(尤其是兒茶素)的氧化，但溶劑提取法過程中茶多酚損失較多。金屬離子法常用的金屬離子有Al3+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+等，其中Zn2+、Al3+是較適宜的弱酸性沉淀劑。余兆祥等9采用Zn2+和Al3+的復合沉淀劑提取低檔綠茶中的茶多酚,提取率為10.4%，較單一沉淀劑高約1%。金屬離子沉淀法的選擇性和產(chǎn)品純度均較高,但在稀酸轉(zhuǎn)溶過程中茶多酚損失較大，且金屬離子有一定的毒性。CO2 是最常用的超臨界流體，具有萃取溫度低、選擇性高、無毒等優(yōu)點，茶多酚在超臨界萃取過程中不易氧化，產(chǎn)品純度高。但由于茶多酚在超臨界CO2中的溶解度小，加入極性改性劑后的一次提取率仍很低，限制了方法的應用。目前超聲提取方法多限于單頻超聲，而復頻超聲除基頻外，還出現(xiàn)倍頻波、和頻波及差頻波，使產(chǎn)生的聲場更加均勻。曹雁平等10 用雙頻復合超聲來提取綠茶中的茶多酚，在濃度、提取率和提取速率方面都優(yōu)于單頻超聲法。用微球吸附法分離提取茶多酚，能有效的解決以上的問題而且工藝簡單、成本低、能耗較低，有助于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物, 是一種可降解的天然高分子。由于具有良好的生物相容性、無毒和粘性等優(yōu)點, 在醫(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域展示出美好的應用前景 11其含有游離氨基，能與稀酸 結(jié)合生成胺鹽而溶于稀酸。由于分子中 2 位上的 氨基反應活性大于基，易發(fā)生化學反應，使殼聚糖可在較溫和的條件下進行多種化學修飾。殼聚糖與丙烯酸通過戊二醛進行接枝共聚制得表面具有兩性基團(-COOH 和-NH2)的殼聚糖-聚丙烯酸微球 12。本文用殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附分離茶湯中茶多酚，討論了殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的條件，并對其吸附動力學進行初步的探討。2 實驗部分2.1 實驗儀器和藥品2.1.1 藥品和試劑甲醇（色譜純），國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈：上海阿拉丁生化科技有限公司，色譜級，99.9%；三蒸水；蒸餾水；鹽酸，乙酸，硫酸，乙二胺四乙酸，過硫酸銨，氫氧化鈉，無水碳酸鈉，戊二醛50%，堿式乙酸鉛，表沒食子兒茶素沒食子酸酯( EGCG)，抗壞血酸，福林酚，咖啡因，丙烯酸，無水乙醇，等均為市售分析純。2.1.2 儀器7200型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；電磁力攪拌器；H.H.S型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TH2-C臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀光廠；HH-4型恒溫水浴鍋：上海君竺儀器制造有限公司；TG328A 型電光分析天平：上海天平儀器廠；prostar-210高效液相色譜儀：美國瓦里安；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司，智能型傅立葉紅外光譜儀，pHS-3C型精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；TG1850-W5型高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。2.2.1殼聚糖-聚丙烯酸微球的制備稱取0.1g殼聚糖至于100mL燒杯中去，取50mL1%乙酸溶液，然后磁力攪拌30min使其完全溶解，加入于10mL20%丙烯酸溶液，2mL1g/L的過硫酸銨在單頸燒瓶中混合均勻，在70條件下回流反應直至出現(xiàn)乳白色后再回流45min，之后倒入100mL燒杯中，冷卻后加入4mL50%戊二醛在磁力攪拌器下攪拌20min，完成后放入抽濾機中抽濾用乙醇清洗，放入40攝氏度烘箱中烘干。得殼聚糖-聚丙烯酸微球。2.2.2茶多酚的定量檢測方法按GB/T 8313-2008 方法檢測茶湯中茶多酚的含量。茶多酚含量（%）=AVdSLOPEStdm106m1100式中： A樣品測試液吸光度； V樣品提取液體積，10mL； d稀釋因子（1mL稀釋25mL）； SLOPEStd沒食子酸標準曲線的斜率； m樣品干物質(zhì)含量，%； m1樣品質(zhì)量，單位為克（g）式中： a吸附前的茶多酚吸光度； b吸附后的茶多酚吸光度； d稀釋因子（1mL稀釋25mL）； SLOPEStd沒食子酸標準曲線的斜率； m樣品干物質(zhì)含量，%； m1樣品質(zhì)量，單位為克（g）2.2.3 高效液相色譜（HPLC）檢測條件按GB/T 8313-2008方法使用液相色譜儀檢測。色譜條件：色譜柱：C18色譜柱（粒徑5um，250mm4.6mm）；流動相A:分別將90mL乙腈， 2mLEDTA，20mL乙酸加入1000Ml容量瓶中，用三蒸水定容至刻度，充分搖勻。溶液需過0.45um膜；流動相B:分別將800mL乙腈， 2mLEDTA20mL乙酸加入1000Ml容量瓶中，用三蒸水定容至刻度，充分搖勻。溶液需過0.45um膜；流動相總流速1mL/min；柱溫：35攝氏度紫外檢測器：=278nm；梯度條件：100%流動相A保持10min15min內(nèi)由100% A相轉(zhuǎn)為68%A相，32% B相68%A相，32%B相保持10分鐘100% A；進樣量：10L。原茶湯，吸附后茶湯，解析后茶湯,茶多酚標準液（用表沒食子兒茶素沒食子酸酯（簡稱EGCG）都在此色譜條件下檢測。3. 結(jié)果與討論3.1恒溫振蕩器的震蕩速率對殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的影響 平行取三份0.30g殼聚糖-聚丙烯酸微球于100mL干燥錐形瓶中，加入25.00mL相同濃度的茶湯，分別置于30r/min、110r/min、220r/min恒溫震蕩器（30）中震蕩2h后取出在經(jīng)離心機（12000r/min）離心10min后取上清液于25mL干燥燒杯中。測定殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰省嶒灲Y(jié)果如圖所示，殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰孰S著轉(zhuǎn)速的提高而增大，在220 r/min時最大吸附率為61.48%，考慮轉(zhuǎn)速太快對機器負擔較大，所以實驗采用的是110 r/min。圖1震蕩速率對吸附率的影響3.2-聚丙烯酸微球用量對殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的影響用移液管分別移取殼聚糖-聚丙烯酸微球0.10g、0.20g、0.30g、0.40 g、0.50 g、0.60 g、0.70 g、0.80 g于100mL干燥錐形瓶中，分別加入25.00mL相同濃度的茶湯。置于30恒溫振蕩器（110r/min）中震蕩2h后取出，在經(jīng)離心機（12000r/min）離心10min后取上清液于25mL干燥燒杯中。測定殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰?。實驗結(jié)果如圖所示，殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰孰S殼聚糖-聚丙烯酸微球的增加先快速上升，后緩慢上升的趨勢，當殼聚糖-聚丙烯酸微球的用量為0.3g時，吸附率基本不再增加，殼聚糖-聚丙烯酸微球用量為0.3g時對茶多酚的吸附率達為63.40%，因此對于25.00mL（吸光度為0.306，質(zhì)量濃度為1.049mg/mL）的茶湯，所取殼聚糖-聚丙烯酸微球0.30g時吸附最佳。圖2殼聚糖-聚丙烯酸微球用量對吸附率的影響3.3溫度-時間對殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的影響平行取25.00m茶湯27份，分別加入0.30g 殼聚糖-聚丙烯酸微球，分成三批置于20、30、40溫振蕩器（110r/min）中，吸附不同時間（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h）后，在經(jīng)離心機（12000r/min）離心10min后取上清液于25mL干燥燒杯中。分別測定殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰?。結(jié)果如圖所示。不同溫度下的吸附率都隨時間的增長逐漸增大，但在吸附2h后吸附率的增加開始減緩，當吸附時間超過3h后，吸附基本達到平衡，吸附率都基本不再增加，最佳吸附率是40下吸附6h為71.07%。隨著溫度的增加，吸附率基本上也是隨著增加的，但增加不是很顯，表明在一般溫度條件下，殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚受溫度影響不大。因為茶多酚在空氣中容易被氧化，所以在殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的過程中，溫度為30 提取時間為2h較好。圖3附時間和吸附溫度對吸附率的影響3.1.3 pH對殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的影響將煮好的茶湯分5份移取于100mL錐形瓶中用0.1(mol/mL)HCl和10(mol/mL) NaOH調(diào)節(jié)pH分別為3、4、5、6、7、8、9，分別測得茶多酚的吸光度，再準確吸取25.00mL于上述錐形瓶中，在分別加入0.3g殼聚糖-聚丙烯酸微球置于30，110r/min的恒溫水浴振蕩器中吸附2h后取出，在經(jīng)離心機（12000r/min）離心10min后取上清液于25mL干燥燒杯中。測定殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰?。結(jié)果如圖所示，在pH=3.00至7.00范圍內(nèi)，殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰时容^高，說明酸性條件下有利于殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈?；但當pH7.00后，殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾游铰孰S著pH增大而逐漸減小，這是、由于茶多酚在堿性的條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化反應，當溶液堿性增強，茶多酚氧化越多。因此殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚，較佳的提取pH值為pH=7.00。圖4 PH值對吸附率的影響3.1.4茶湯濃度對殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附茶多酚的影響用4g茶末配置出茶湯，用蒸餾水稀釋分別稀釋成20%、40%、60%、80%、100%的茶湯，分別測得茶多酚含量，再準確吸取25.00mL于錐形瓶中，加入0.3g殼聚糖-聚丙烯酸微球，置于20，30，40，110r/min的恒溫水浴振蕩器中吸附2h。取出，測殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰?。如圖所示，在不同的溫度下隨茶湯溶度的升高，殼聚糖-聚丙烯酸微球?qū)Σ瓒喾拥奈铰手饾u降低，但從吸附的量來看還是100時吸附的最多。圖5濃度和溫度對吸附率的影響3.2 殼聚糖-聚丙烯酸微吸附前后茶湯的HPLC對比分析圖6 EGCG的色譜圖圖7 CAF的色譜圖圖8 GA的色譜圖圖9 原茶湯的色譜圖圖10吸附后的色譜圖圖11 吸附后+EGCG的色譜圖圖12 脫附后的色譜圖圖13 脫附后+EGCG的色譜圖按照3.2，殼聚糖-聚丙烯酸微球吸附前后的茶湯溶液進行HPLC分析，并進行譜圖對比分析，結(jié)果見圖8、圖9、圖10。由圖8和參考文獻13可知，6種兒茶素類物質(zhì)和2種生物堿（咖啡因、可可堿THEO）得到了一定的分離，但基線部分有重疊。8種化合物的保留時間分別為GA 3.501min、THEO 3.903min、EGC 4.529min、C 5.883min、EGCG 10.048min、CAF 10.642min、EC 16.261min、ECG 25.832min。由圖8和圖9對比分析可知，EGCG峰吸附后比吸附前小很多，說明EGCG有效地被吸附，而CAF的峰吸附前后變化不大，說明CAF大部分殘留在吸附后的溶液中而被除去。所以可說明，殼聚糖-沸石膜對茶多酚和咖啡因具有選擇性吸附特性，特別是對EGCG有選擇性吸附。4 結(jié)論殼聚糖由于表面含有豐富的-NH2、-OH等功能基團, 可通過氫鍵作用吸附茶多酚。本實驗制備了殼聚糖-聚丙烯酸微球，用其進行吸附分離茶多酚，實驗結(jié)果表明，對25.00mL質(zhì)量濃度為1.049mg/mL的茶湯，較佳的吸附條件為0.3g殼聚糖-聚丙烯酸微球、吸附時間2h、茶湯pH7.00、溫度30，吸附率可達到76.36 %，單位吸附量可達171.24mg/g；殼聚糖-沸石膜對茶多酚和咖啡因具有選擇性吸附特性，特別是對EGCG有選擇性吸附。由于殼聚糖是自然界中來源僅次于纖維素的天然高分子，且具有無毒、良好的生物相容性、生物可降解性、易成形加工等優(yōu)點，使殼聚糖膜在茶多酚的吸附分離中必將具有美好的應用前景。5 致謝非常感謝薛麗群老師、薛麗群老師在我大學的最后學習階段畢業(yè)實驗階段給自己的指導，從最初的定題，到后面的實驗的處理過程中，她們給了我耐心的指導和無私的幫助。為了指導我們的畢業(yè)實驗，她們放棄了很多自己的休息時間，在此我向她們表示我誠摯的謝意。同時，也要感謝所有任課老師和所有同學在這四年來給自己的指導和幫助，在此向他們表示我由衷的感謝，并祝所有的老師能夠培養(yǎng)出越來越多的優(yōu)秀人才!參考文獻：1 陳鐿文.茶多酚粗品的精制及兒茶素單體分離的工藝研究D.西北大學.2005:6-7.2 盛 麗,任愛梅.天然抗氧劑茶多酚J.化學教育,2004,11:8.3王棟，康健。茶多酚的功效，提取和應用前景D，1000-2839(2007)02-0217-05 4 胥佰濤, 徐平, 沈生榮.茶多酚提取方法研究進展J.茶葉,2007(3):43-46.5 郭宇姝, 張沂,朱新生.茶多酚的提取分離與含量測定方法進展J.解放軍藥學學報, 2007, 23 (2):121-124. 6 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