宋存江《生物技術(shù)概論》2.基因工程-新

2 基因工程 學(xué)習(xí)目的學(xué)習(xí)基因工程基本原理和基本操作過程 為進(jìn)一步學(xué)習(xí)生物技術(shù)相關(guān)知識(shí)和從事基因工程工作打下基礎(chǔ) 2 1基因工程概況2 1 1基因工程的基本含義按照人們的愿望 人為的 進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì) 類似工程設(shè)計(jì) 通過體外DNA重組 非生命活動(dòng)過程 和轉(zhuǎn)基因等技術(shù) 有目的地改造生物種性 使現(xiàn)有的物種在較短的時(shí)間內(nèi)趨于完善 區(qū)別于自然突變和常規(guī)育種 創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型 利用這種技術(shù)對(duì)人類疾病進(jìn)行有效的診斷和治療 基因工程2基因工程 2 1 2基因工程的主要理論依據(jù)不同基因具有相同的遺傳物質(zhì) DNA RNA 基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的 絕少數(shù)除外 可以通過DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代 基因工程2 1基因工程概況 2 1 3基因工程研究的基本技術(shù)路線 基因工程2 1基因工程概況 2 1 4基因工程突出的優(yōu)點(diǎn)打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使動(dòng)物與植物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使人與其他生物間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移 基因工程2 1基因工程概況 2 2 1DNA2 2 1 1DNA的組成和結(jié)構(gòu) 基因工程2基因工程 DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸 鳥嘌呤脫氧核苷酸 胞嘧啶脫氧核苷酸 胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成 脫氧核苷酸由脫氧核糖 堿基和磷酸基組成 四種脫氧核苷酸的脫氧核糖 磷酸基的結(jié)構(gòu)和位置相同 只是各自的堿基不同 2 2DNA重組 堿基有腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G 胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 4種 脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接 多個(gè)脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸 其一端為游離的5 磷酸基 5 P 稱為5 端 另其一端為游離的3 羥基 3 OH 稱為3 端 基因工程2 2 1 1DNA的組成和結(jié)構(gòu) 基因工程2 2 1 1DNA的組成和結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補(bǔ)配對(duì)和G與C互補(bǔ)配對(duì)的 通過氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu) 稱為雙鏈DNA 少數(shù)病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的 基因工程2 2 1 1DNA的組成和結(jié)構(gòu) B DNA雙螺旋分子模型 基因工程2 2 1 1DNA的組成和結(jié)構(gòu) 2 2 1 2DNA的功能 1 DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制以原有的DNA鏈為模板 從特定的復(fù)制起始位點(diǎn) ori 起始 復(fù)制出新的DNA鏈 2 DNA是基因的主要攜帶者一個(gè)基因是DNA分子上的一個(gè)特定的核苷酸序列 基因工程2 2 1DNA 基因工程2 2 1 2DNA的功能 原核生物基因啟動(dòng)子相關(guān)的保守核苷酸序列Pribnow框或 10區(qū) 4 13bp之間由 個(gè)核苷酸組成 多數(shù)是TATAAT序列 35區(qū) 35bp前后保守的TTGACA序列 動(dòng) 植物基因啟動(dòng)子相關(guān)的保守核苷酸序列 基因工程2 2 1 2DNA的功能 終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列 基因工程2 2 1 2DNA的功能 2 2 2獲得DNA片段的主要途徑目的 1 獲得含有基因的DNA片段 2 獲得含有基因表達(dá)調(diào)控因子的DNA片段 3 獲得含有與基因重組有關(guān)的核苷酸序列的DNA片段主要途徑 1 限制性內(nèi)切核酸酶酶切法 2 PCR擴(kuò)增法 3 化學(xué)合成法 基因工程2 2DNA重組 2 2 2 1限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化限制性內(nèi)切核酸酶 restrictionendonuclease 功能 能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列 并在合適的反應(yīng)條件下 使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開 產(chǎn)生具有3 OH和5 P的DNA片段 命名 HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中屬名的H 種名的in和菌株代號(hào)的d組成 III表示從此菌株中提取的第三種限制性內(nèi)切核酸酶 識(shí)別序列規(guī)律 旋轉(zhuǎn)對(duì)稱或左右互補(bǔ)對(duì)稱 切割位點(diǎn) 在識(shí)別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置 基因工程2 2 2獲得DNA片段的主要途徑 限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列 酶切位點(diǎn)和酶切片段末端 基因工程2 2 2 1限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化 粘性末端 產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸 3 端比5 端長的稱為3 粘性末端 5 端比3 端長的稱為5 粘性末端 平末端 產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的 限制性內(nèi)切核酸酶的切割方法 單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法 環(huán)狀DNA酶切片段示意圖 基因工程2 2 2 1限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化 2 2 2 2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增特點(diǎn) 體外高效擴(kuò)增特異DNA片段 一個(gè)待擴(kuò)增的DNA片段 在3h內(nèi)可擴(kuò)增出約106個(gè)這樣的DNA片段 關(guān)鍵因子 耐熱性DNA聚合酶 引物 基因工程2 2 2獲得DNA片段的主要途徑 反應(yīng)過程 反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90 95 底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA 降溫至37 60 使引物與模板DNA鏈互補(bǔ)序列雜交 復(fù)性 升溫至70 75 耐熱性DNA聚合酶催化引物按5 3 方向延伸 合成模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈 重復(fù)以上過程 一般經(jīng)過25 30次循環(huán)片段 基因工程2 2 2 2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增 基因工程2 2 2 2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)五要素 引物 軟件設(shè)計(jì) Taq酶 脫氧核糖核酸polymerase dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 模板Mg2 5 Primer1 5 Primer2 5 5 TemplateDNA PCR擴(kuò)增特異性DNA片段過程 after25cycles amplification 225 1x106foldafter45cycles amplification 245 3 5x1012fold 2 耐熱性DNA聚合酶在使靶DNA變性的高溫下仍保持活性 3 PCR引物引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補(bǔ) 并能引導(dǎo)模板DNA互補(bǔ)鏈合成的一種脫氧核苷酸寡聚體 3 端必須具備游離的 OH 4 DNA片段PCR擴(kuò)增系統(tǒng) 2 2 2 3化學(xué)合成目的基因根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列 采用DNA合成儀 將4種核苷酸單體按3 5 磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段 基因工程2 2 2獲得DNA片段的主要途徑 DNA合成儀 2 2 3DNA片段的連接2 2 3 1DNA連接酶 DNAligase 催化機(jī)理 催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3 OH末端與5 P末端之間形成磷酸二酯鍵 使兩末端連接 目前常用的連接酶 E coliDNA連接酶或T4DNA連接酶 基因工程2 2DNA重組 具互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接 基因工程2 2 3DNA片段的連接 2 2 3 2DNA片段之間的連接 基因工程2 2 3 2DNA片段之間的連接 具平末端DNA片段之間的連接 基因工程2 2 3 2DNA片段之間的連接 DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接 DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接 基因工程2 2 3 2DNA片段之間的連接 DNA片段脫磷酸化后連接 DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接 基因工程2 2 3 2DNA片段之間的連接 DNA片段加連桿后或加銜接頭連接 基因工程2 2 3 2DNA片段之間的連接 2 2 3 3DNA重組類型插入重組置換重組 基因工程2 2 3DNA片段的連接 3月21日 基因工程2基因工程 基因克隆載體的含義能夠承載外源基因 并將其帶入受體細(xì)胞得以相對(duì)穩(wěn)定維持的DNA分子稱為基因克隆載體 genecloningvector 2 3基因克隆載體 轉(zhuǎn)基因研究中 單獨(dú)一個(gè)基因或組成基因的某個(gè)元件 一般不易進(jìn)入受體細(xì)胞 也不易在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持 基因克隆載體應(yīng)具備的基本條件 1 含有允許外源DNA片段組入的多克隆位點(diǎn) 2 能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞 或復(fù)制或整合 3 具有合適的篩選標(biāo)記根據(jù)轉(zhuǎn)化子抗藥性進(jìn)行篩選的ampr 根據(jù)轉(zhuǎn)化子藍(lán)白顏色進(jìn)行篩選的lacZ 表達(dá)產(chǎn)物gfp等 4 克隆載體必須安全 不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害基因 不會(huì)任意轉(zhuǎn)入其他細(xì)胞 利用 半乳糖苷酶插入失活的載體 在生色底物 X gal 和誘導(dǎo)物 1PTG 存在時(shí) 可形成深藍(lán)色菌斑 用這種載體進(jìn)行克隆時(shí) 半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代 所產(chǎn)生的重組體喪失 互補(bǔ)能力 在含有X gal和IPTG的平板下形成無色菌斑 因此 對(duì)于這類重組載體 可通過組織化學(xué)方法進(jìn)行重組子的篩選 藍(lán)白斑篩選 克隆載體種類按構(gòu)建克隆載體的材料來源分 質(zhì)?？寺≥d體 病毒 噬菌體 克隆載體 線粒體克隆載 人工染色體克隆載體 葉綠體克隆載體 按克隆載體的用途分 一般克隆載體 表達(dá)載體 建庫載體 T或U載體 基因工程2 3基因克隆載體 按克隆載體的受體生物分 原核生物克隆載體大腸桿菌克隆載體 放線菌克隆載體 真核生物克隆載體酵母克隆載體 植物克隆載體 動(dòng)物克隆載體 人克隆載體 基因工程2 3基因克隆載體 克隆載體種類 含義 以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體 必須含有質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn) 種類 大腸桿菌質(zhì)粒載體藍(lán)藻穿梭質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體酵母2 m質(zhì)粒載體 2 3 1質(zhì)?？寺≥d體 基因工程2 3基因克隆載體 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的 能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制 并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子 質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中 一般以cccDNA的形式存在 絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià) 封閉 環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu) 基因工程2 3 1質(zhì)?？寺≥d體 1 大腸桿菌質(zhì)粒載體 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制 pBR322 氯霉素可擴(kuò)增 拷貝數(shù)50 100 cell 用于基因克隆 pBR322簡圖 基因工程2 3 1質(zhì)?？寺≥d體 選擇標(biāo)記基因 抗藥性基因 氨芐青霉素 Ap或Amp 氯霉素 Cm或Cmp 卡那霉素 Kn或Kan 四環(huán)素 Tc或Tet 鏈霉素 Sm或Str 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pUC18 19 拷貝數(shù)2000 3000 cell 用于基因克隆和測序 裝有多克隆位點(diǎn) MCS 正選擇顏色標(biāo)記lacZ 基因工程2 3 1質(zhì)?？寺≥d體 2 藍(lán)藻和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體 人工構(gòu)建 含有不止一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) 能攜帶外源DNA序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制 擴(kuò)增 3 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體 基因工程2 3 1質(zhì)?？寺≥d體 4 酵母2 m質(zhì)粒載體存在于真核微生物酵母菌細(xì)胞核中但獨(dú)立于染色體內(nèi)的長度為2 m并與組蛋白相結(jié)合的DNA質(zhì)粒 病毒 噬菌體 克隆載體 含義以病毒 噬菌體 DNA或cDNA為主構(gòu)建的克隆載體 或者通過轉(zhuǎn)染直接進(jìn)入宿主細(xì)胞 或者包裝成病毒顆粒后通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞 種類噬菌體克隆載體 噬菌體克隆載體Cosmid載體植物病毒克隆載體 CaMV克隆載體動(dòng)物病毒克隆載體 痘苗病毒載體腺病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體 2 3 2病毒 噬菌體 克隆載體 基因工程2 3基因克隆載體 大腸桿菌的l噬菌體DNA l噬菌體的生物學(xué)特性 生物結(jié)構(gòu) l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體 l噬菌體由外殼包裝蛋白和l DNA組成 l DNA全長48502個(gè)核苷酸 l DNA上至少有61個(gè)基因 I噬菌體克隆載體 l噬菌體生物學(xué)特性 生物結(jié)構(gòu) 5 TCCAGCGGCGGGG 3 3 CCCGCCGCTGGA5 COS COS cos 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 l DNA 此末端稱為cos位點(diǎn) 此末端稱為cos位點(diǎn) 大腸桿菌的l噬菌體DNA l噬菌體生物學(xué)特性 感染周期 E coli 吸附 LamB受體 注入 復(fù)制 包裝 裂解 噬菌體或病毒DNA 大腸桿菌的l噬菌體DNA l噬菌體生物學(xué)特性 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后 除能裂解細(xì)胞外 也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上 并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 這種情況為溶原狀態(tài) 整合主要由l DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活 而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) 人們可以根據(jù)需要改變l DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì) 使噬菌體或處于溶原狀態(tài) 或處于溶菌狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài) 噬菌體或病毒DNA 噬菌體或病毒DNA 大腸桿菌的l噬菌體DNA l DNA載體的構(gòu)建 縮短長度取代型載體 體外包裝 體外包裝 插入片段 最小裝載長度10kb 51 26 載體長度26kb 插入片段 最大裝載長度25kb 36 26 基因工程2 3 2病毒 噬菌體 克隆載體 cosmid載體 cosmid載體是一類人工構(gòu)建的含有 1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建 pHC79 6400bp Tcr lfragment cos ori Apr PstI BamHI SalI l DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的 特殊類型的載體 cossite carryingplasmid 1 8kb的l DNA片段 pBR322片段 裝載范圍為30 45kb 考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn) 能像l DNA那樣進(jìn)行體外包裝 并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大 45kb 且克隆片段具有一定的大小范圍 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制 重組操作簡便 篩選容易 不能體內(nèi)包裝 不裂解受體細(xì)胞 cosmid載體 II植物病毒克隆載體 煙草花葉病毒 TMV 克隆載體 III動(dòng)物病毒克隆載體 腺病毒克隆載體腺病毒 adenovirus Ad 是一類無囊膜的20面體病毒 含有一個(gè)線性雙鏈DNA分子 Ad DNA兩端具有逆向末端重復(fù)序列IRT 在每一條單鏈DNA的5 端共價(jià)結(jié)合一種特殊結(jié)合蛋白 5 5kD TP 當(dāng)DNA從病毒顆粒中釋放后 通過該蛋白連接成環(huán)狀 基因工程2 3 2病毒 噬菌體 克隆載體 2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 1 含義 指能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并準(zhǔn)確傳遞給子細(xì)胞的人工構(gòu)建的染色體 2 特點(diǎn) 能容納長達(dá)1000kb以上的外源DNA片段 3 用途 構(gòu)建基因組文庫 克隆和轉(zhuǎn)移完整的高分子量基因 基因功能鑒定 基因治療 基因工程2 3基因克隆載體 4 類型 線形的人工染色體 必須含有端粒 著絲粒和復(fù)制起始區(qū) 包含 酵母人工染色體 YAC 人類人工染色體 HAC 哺乳動(dòng)物人工染色體 MAC 環(huán)形的人工染色體 不需要端粒和著絲粒 但必須含有合適的復(fù)制起始區(qū) 包含 細(xì)菌人工染色體 BAC 源于噬菌體 1的人工染色體 PAC 雙元細(xì)菌人工染色體 BIBAC 可轉(zhuǎn)化人工染色體 TAC 基因工程2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 人工染色體載體 細(xì)菌人工染色體 BacterialArtificialChromosomesBAC 細(xì)菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上 構(gòu)建的 其裝載量范圍在50 300kb之間 各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pBACs主要適用于 克隆大型基因簇 genecluster 結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫 基因工程2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 基因工程2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 人工染色體載體 酵母人工染色體 YeastArtificialChromosomesYAC YAC載體應(yīng)含有下列元件 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為350 400kb 人造染色體載體 酵母人造染色體 YeastArtificialChromosomesYAC 酵母人造染色體的使用 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 基因工程2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 基因工程2 3 3人工染色體載體 大DNA片段克隆載體 構(gòu)建人類人工染色體的基本策略 HAC 人工染色體的某些性質(zhì)表 2 3 4體內(nèi)同源重組整合載體 系統(tǒng) 原理 兩個(gè)不同的DNA分子在同源序列處發(fā)生重組 將各自攜帶的處于同源序列內(nèi)的遺傳信息互相交換 系統(tǒng)包括 整合平臺(tái) 受體細(xì)胞基因組上給定的一個(gè)DNA區(qū)域 是外源DNA的定位整合位置 定為整合載體 除了一般質(zhì)粒載體應(yīng)有的元件外 還必須含有一或兩個(gè)與整合平臺(tái)DNA區(qū)域同源的DNA片段 2 3 4 1常規(guī)基因整合平臺(tái)系統(tǒng)內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換載體內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入載體內(nèi)源平臺(tái)單交換插入載體外源平臺(tái)雙交換插入載體 基因工程2 3 4 1常規(guī)基因整合平臺(tái)系統(tǒng) 基因工程2 3 4 1常規(guī)基因整合平臺(tái)系統(tǒng) 基于噬菌體P1的Cre lox定位重組系統(tǒng) 位點(diǎn)特異性重組 即體內(nèi)發(fā)生的兩條DNA特異位點(diǎn)上的同源重組 發(fā)生時(shí)需一段同源序列 特異性位點(diǎn) 和位點(diǎn)特異性的重組酶參與 Cre lox定位重組系統(tǒng)包括特異性重組位點(diǎn)loxP和催化重組反應(yīng)的特異性重組酶Cre 重組中 基于loxP位點(diǎn)的多少 所處的位置和排列的方向不同 在重組反應(yīng)過程中會(huì)出現(xiàn)多種重組方式 近年來建立了體內(nèi)位點(diǎn)特異性重組 即體內(nèi)發(fā)生的兩條DNA特異位點(diǎn)上的同源重組 避免上述常規(guī)基因定位整合系統(tǒng)存在的問題 loxP位點(diǎn)序列示意圖 2 3 4 2基于噬菌體P1的Cre lox定位重組系統(tǒng) 基因工程2 3 4體內(nèi)同源重組整合載體 系統(tǒng) 基因工程2 3 4 2基于噬菌體P1的Cre lox定位重組系統(tǒng) 2 4 1目的基因來源 目的基因 在基因工程設(shè)計(jì)和操作中 被用于基因重組 改變受體細(xì)胞性狀和獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因 目的基因的生物來源 真核生物染色體基因組原核生物染色體基因組質(zhì)粒基因組病毒 噬菌體 基因組線粒體基因組葉綠體基因組 基因工程2基因工程 2 4獲得目的基因 2 4 2分離目的基因的途徑 酶切直接分離法PCR擴(kuò)增法化學(xué)合成法構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離法 基因工程2 4獲得目的基因 2 4 2 1利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離目的基因 基因工程2 4獲得目的基因 PCR擴(kuò)增含目的基因DNA示意 基因工程2 4 2分離目的基因的途徑 2 4 2 2利用PCR直接擴(kuò)增目的基因 基因工程2 4 2分離目的基因的途徑 2 4 2 3目的基因的化學(xué)合成 2 4 2 4構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因 基因組文庫把某種生物基因組的全部遺傳信息通過通過克隆載體貯存在一個(gè)受體菌克隆子群體中 這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫經(jīng)驗(yàn)公式 N ln 1 P ln 1 f N 基因組文庫必須的克隆子數(shù)P 文庫中目的基因出現(xiàn)的概率f 克隆DNA片段的平均大小與基因組大小的比值 構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離法 cDNA文庫以mRNA為模板 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化 在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA 與適當(dāng)?shù)妮d體 常用噬菌體或質(zhì)粒載體 連接后轉(zhuǎn)化受體菌 則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA 并能繁殖擴(kuò)增 這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫 基因工程2 4 2分離目的基因的途徑 從基因組文庫或cDNA文庫中獲得目的基因 根據(jù)目的基因已知核苷酸序列制備核酸探針 進(jìn)行篩選分離根據(jù)目的基因特異性表達(dá)進(jìn)行分離 基因組文庫cDNA文庫 信息供體DNAmRNA 載體噬菌體 黏粒 人工染色體質(zhì)粒 噬菌體 連接前部分酶切 分級(jí)分離反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈 連接粘端連接 人工接頭同聚物加尾 人工接頭 篩選核酸探針核酸探針 免疫探針 基因組文庫和cDNA文庫的比較 基因工程2 4 2 4通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因 2 5 1受體細(xì)胞2 5 1 1原核生物種類 大腸桿菌 枯草桿菌 藍(lán)細(xì)菌 棒狀桿菌 放線菌等 基因工程2基因工程 2 5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 重組DNA分子能否有效地進(jìn)入受體細(xì)胞 除了選用合適的克隆載體外 還取決于選用的受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)移方法 受體細(xì)胞 receptorcell 又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞 hostcell 可作為受體細(xì)胞的原則 便于重組DNA分子導(dǎo)入和篩選 便于重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中 適于外源基因的高效表達(dá) 遺傳穩(wěn)定性高 密碼子無明顯偏愛性 易于擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵 安全性高 無致病性 一 原核生物細(xì)胞 作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 1 不具纖維素壁 2 無核膜 3 基因組簡單 便于遺傳分析 4 單細(xì)胞 作為受體細(xì)胞的不足 1 不具真核蛋白折疊系統(tǒng) 2 不具真核蛋白加工系統(tǒng) 3 蛋白酶降解異源蛋白 目前作為受體菌的原核生物有 1 大腸桿菌革蘭氏陰性菌a 基因組 遺傳背景了解最清楚b 易培養(yǎng) 繁殖迅速 2 枯草桿菌革蘭氏陽性菌a 具胞外酶分泌 調(diào)節(jié)基因 能將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基 b 無內(nèi)毒素 c 易于保存與培養(yǎng) 3 藍(lán)細(xì)菌a 光能自養(yǎng)型 易于培養(yǎng) b 與植物密碼子和啟動(dòng)子的通用性 易于表達(dá)植物基因 特點(diǎn) 大部分原核生物細(xì)胞沒有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁 便于外源DNA的進(jìn)入 沒有核膜 染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì) 這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩 基因組小 遺傳背景簡單 并且不含線粒體和質(zhì)體基因組 便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析 原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物 容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料 并且培養(yǎng)簡單 繁殖迅速 實(shí)驗(yàn)周期短 重復(fù)實(shí)驗(yàn)快 基因工程2 5 1 1原核生物 2 5 1 2真核生物特點(diǎn) 真核生物細(xì)胞具備真核基因表達(dá)調(diào)控以及表達(dá)產(chǎn)物加工和分泌等的機(jī)制 因此作為受體細(xì)胞表達(dá)真核基因優(yōu)于原核生物細(xì)胞 低等真核生物 具有真核生物基因結(jié)構(gòu)表達(dá)調(diào)控體系 具有真核的蛋白折疊 加工與分泌系統(tǒng) 基因工程2 5 1受體細(xì)胞 真核細(xì)胞模式圖 酵母菌a 結(jié)構(gòu)最簡單的真核生物 遺傳背景較為清楚b 易培養(yǎng)c 可分泌d 不含毒素 植物細(xì)胞 具有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 纖維素酶處理 基因槍或農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的突出優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞具有全能性 動(dòng)物細(xì)胞多采用生殖細(xì)胞 受精細(xì)胞或胚細(xì)胞 近年用體細(xì)胞培養(yǎng)常用的動(dòng)物細(xì)胞受體 小鼠L細(xì)胞 Hela細(xì)胞 猴腎細(xì)胞 中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO 等 動(dòng)物細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 可識(shí)別并除去內(nèi)含子 加工成成熟mRNAb 翻譯后加工 產(chǎn)物具有較好的免疫原性c 易感染 遺傳穩(wěn)定d 可分泌表達(dá)產(chǎn)物缺點(diǎn) 組織培養(yǎng)技術(shù)要求較高 周期長 難度大 種類 酵母 基因結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡單 便于基因工程操作 培養(yǎng)簡單 適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn) 成本低廉 外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中 便于產(chǎn)物的提取和加工 不含特異性的病毒 不產(chǎn)生毒素 是安全的受體細(xì)胞 植物細(xì)胞 具全能性 有水稻 棉花 玉米 馬鈴薯 煙草和擬南芥等 動(dòng)物細(xì)胞 目前多采用生殖細(xì)胞 受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞以及干細(xì)胞 有豬 羊 牛 魚 鼠 猴等 基因工程2 5 1 2真核生物 課程論文介紹 生物技術(shù)概論課程論文參考題目 1 生物技術(shù)對(duì)人類進(jìn)步 經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展具有重要意義2基因克隆載體的研究進(jìn)展3重組子鑒定 基因工程應(yīng)用 4細(xì)胞工程研究現(xiàn)狀 植物或動(dòng)物或微生物細(xì)胞工程 5 抗生素的利與弊6 中國酒類發(fā)酵的過去 現(xiàn)在和將來7 某發(fā)酵產(chǎn)品 的研究進(jìn)展8 生物酶工程進(jìn)展9 生物酶的固定化10 生物酶在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用 11 蛋白質(zhì)工程的發(fā)展歷程12 生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)13 生物技術(shù)與種植業(yè) 14 現(xiàn)代生物技術(shù)與養(yǎng)殖業(yè) 15 生物農(nóng)藥 生物技術(shù)與食品生物技術(shù)與食品生產(chǎn)生物技術(shù)與食品檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測生物技術(shù)與人類健康生物技術(shù)與疫苗生物技術(shù)與疾病診斷生物技術(shù)與生物制藥生物技術(shù)與生物療法生物技術(shù)與能源微生物與采油生物乙醇植物石油甲烷與燃料源燃料電池 生物氫生物技術(shù)與環(huán)境污水處理大氣凈化固廢處理環(huán)境生物修復(fù)污染監(jiān)測與評(píng)價(jià)生物技術(shù)的安全性及其影響微生物技術(shù)轉(zhuǎn)基因食品動(dòng)物克隆生物武器 參考文獻(xiàn)要求 每組需參考文獻(xiàn)十篇以上 字?jǐn)?shù) 4000字以上 3月28日 2 5 2重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 基因工程2基因工程 2 5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 重組DNA分子能否有效地進(jìn)入受體細(xì)胞 除了選用合適的克隆載體外 還取決于選用的受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)移方法 受體細(xì)胞 receptorcell 又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞 hostcell 可作為受體細(xì)胞的原則 便于重組DNA分子導(dǎo)入和篩選 便于重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中 適于外源基因的高效表達(dá) 遺傳穩(wěn)定性高 密碼子無明顯偏愛性 易于擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵 安全性高 無致病性 2 5 2 1外源DNA轉(zhuǎn)化方法化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法微彈轟擊 基因槍 轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法超聲波處理轉(zhuǎn)化法脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法花粉管通道轉(zhuǎn)化法精子介導(dǎo)法低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 基因工程2 5 2 1外源DNA轉(zhuǎn)化方法 電穿孔儀 電轉(zhuǎn)化儀 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)化 transformation 重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞 并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持并表達(dá)的過程 化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 制備感受態(tài)細(xì)胞二價(jià)陽離子 如Ca2 處理受體細(xì)胞 可以使其成為感受態(tài)細(xì)胞 即處于能攝取外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞 DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞加入DNA分子42 C水浴上放置45秒 熱激 會(huì)有DNA分子進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞里 CaCl2引起大腸桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)可能的原因 Ca2 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu) 使內(nèi)外膜間核酸酶解離 誘導(dǎo)形成感受態(tài) Ca2 能與DNA分子結(jié)合 使DNA與Ca2 復(fù)合物接近細(xì)胞膜 當(dāng)42 C熱激處理時(shí) 膜出現(xiàn)間隙 DNA分子進(jìn)入 用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化 電穿孔轉(zhuǎn)化法 1988年 Dower等人轉(zhuǎn)化大腸桿菌基本原理 高壓電脈沖導(dǎo)致電穿孔 electroporation 體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法 2 5 2 2病毒 噬菌體 顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法用病毒 噬菌體 的DNA 或cDNA 構(gòu)建成重組DNA 在體外包裝成重組病毒 噬菌體 顆粒 通過感染使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞 基因工程2 5 2重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 方式 重組病毒直接感染受體細(xì)胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞重組病毒感染互補(bǔ)型受體細(xì)胞系適用 主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和動(dòng)植物的轉(zhuǎn)基因 基因工程2 5 2 2病毒 噬菌體 顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 基因工程2 5 2 2病毒 噬菌體 顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 克隆子的篩選 克隆子導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞為轉(zhuǎn)化子 含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子為克隆子篩選 screening 選擇 selection 2 5 3克隆子的篩選2 5 3 1根據(jù)載體標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體抗菌素抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體除草劑抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)LacZ 基因互補(bǔ)顯色篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子 基因工程2 5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 氨芐青霉素 Ap或Amp 氯霉素 Cm或Cmp 卡那霉素 Kn或Kan 四環(huán)素 Tc或Tet 鏈霉素 Sm或Str 1 抗藥性標(biāo)志篩選 抗性平板 2 根據(jù)載體除草劑抗性基因和相應(yīng)的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子 由于植物細(xì)胞對(duì)多數(shù)抗生素不敏感 所以常用抗除草劑的基因作為選擇標(biāo)記基因 互補(bǔ)篩選 藍(lán) 白篩選 3 lacZ 基因顯色互補(bǔ)篩選法 互補(bǔ)篩選 藍(lán) 白篩選 互補(bǔ) 半乳糖苷酶基因 LacZ 載體 含LacZ LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息 編碼 互補(bǔ)肽宿主菌編碼的缺陷型 半乳糖苷酶 肽段 lacZ 基因顯色互補(bǔ)篩選法 半乳糖苷酶可在誘導(dǎo)劑IPTG存在的情況下 使底物X gal轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色產(chǎn)物 使細(xì)菌克隆或噬斑呈藍(lán)色 當(dāng)外源DNA片段插入載體的多克隆位點(diǎn)后 便不能表達(dá) 片段 轉(zhuǎn)化細(xì)菌后不能分解底物 結(jié)果使菌落或噬斑呈現(xiàn)白色 因此 互補(bǔ)篩選又稱藍(lán) 白篩選 載體上有 半乳糖苷酶N端編碼序列 細(xì)菌染色體DNA有 半乳糖苷酶C端編碼序列 藍(lán) 白篩選 4 根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子 該標(biāo)記基因產(chǎn)物是激素合成所必須酶類在培養(yǎng)基中不添加外源激素的情況下 只有轉(zhuǎn)化子才能生長 常用于篩選植物轉(zhuǎn)化子 5 根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子 這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡 只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長 主要用于篩選動(dòng)物轉(zhuǎn)化子 2 利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇標(biāo)記基因 selectivegene 報(bào)告基因 reportergene 利用選擇壓力 將轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞篩選出來 表達(dá)報(bào)告基因或與某基因做成嵌合基因 表達(dá)融合蛋白 從報(bào)告基因的表達(dá)情況了解目的基因的表達(dá)情況及推測基因調(diào)控序列 葡萄糖酸苷酶基因 gus 螢火蟲熒光素酶基因 luc 綠色熒光蛋白基因 gfp 3 根據(jù)形成噬菌斑篩選 噬菌體有效包裝為 外源DNA插入 重組DNA分子的大小必須在野生型 DNA長度的75 105 范圍內(nèi) 外源DNA與 DNA載體重組處理后 只有重組DNA分子才能體外包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌 在培養(yǎng)基上形成噬菌斑 并且未轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體均繼續(xù)正常生長 2 6 1根據(jù)重組DNA分子特征鑒定重組子2 6 1 1根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子2 6 1 2根據(jù)重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子2 6 1 3根據(jù)PCR擴(kuò)增片段鑒定重組子 基因工程2基因工程 2 6重組子的鑒定 獲得轉(zhuǎn)化子后 還需分析以下項(xiàng)目 重組DNA片段目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯的多肽 蛋白質(zhì) 酶 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 1 分子大小 A B 2 限制性核酸內(nèi)切酶分析法 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 3 利用PCR擴(kuò)增片段篩選重組子 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 4 核酸分子雜交檢測法核酸分子雜交技術(shù) 具一定同源性的兩條 DNA或RNA 單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下 可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性 形成雙鏈 探針 已知核酸片斷 單鏈 待測核苷酸序列 單鏈 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 2 6 1 4采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交菌落 或噬菌斑 原位雜交 基因工程2 6 1根據(jù)重組DNA分子鑒定重組子 基因工程2 6 1 4采用DNA分子雜交法鑒定重組子 Southern印跡雜交1975年 E Southern首先建立針對(duì)于DNA的雜交技術(shù) 又稱DNA印跡雜交 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 Southern印跡雜交 基因工程2 6 1 4采用DNA分子雜交法鑒定重組子 用限制性酶切DNA 瓊脂糖凝膠電泳 Southern印跡雜交的基本步驟 DNA轉(zhuǎn)膜 雙鏈DNA堿變性 單鏈DNA 硝酸纖維素膜或尼龍膜 轉(zhuǎn)膜 電轉(zhuǎn)移 虹吸作用 菌落 或噬菌斑 原位雜交 基因工程2 6 1 4采用DNA分子雜交法鑒定重組子 2 菌落 或噬菌體 原位雜交1975年 M Grunstein和D Hosness提出菌落原位雜交1977年 W D Benton和R W Davis噬菌斑原位雜交不必分離細(xì)菌或噬菌體DNA 經(jīng)溶菌和變性處理后 使DNA暴露出來并于濾膜結(jié)合 硝酸纖維膜 變性 用探針雜交 成像 3 核酸雜交的探針 1 常用探針類型 同源或部分同源19 24bp 總cDNA探針 特異cDNA探針 人工合成寡核苷酸探針 2 探針標(biāo)記物 放射性標(biāo)記物32P高放射性半衰期14 3d35S放射性較弱半衰期87 1d3H放射性弱半衰期12 35a 非放射性標(biāo)記物生物素 biotin 地高辛 digoxigenin 根據(jù)重組DNA分子特征鑒定 5 應(yīng)用DNA芯片鑒定重組子DNA芯片利用反向雜交原理 使固定化的探針陣列與樣品雜交 通過熒光掃描和計(jì)算機(jī)分析 獲得樣品中大量基因及表達(dá)信息 DNA芯片由載體 連接層和DNA分子探針陣列三部分構(gòu)成 基因工程2 6 1根據(jù)重組DNA分子鑒定重組子 2 6 1 5應(yīng)用 芯片鑒定重組子 基因工程2 6 1根據(jù)重組DNA分子鑒定重組子 2 6 1 6根據(jù)DNA序列鑒定重組子 2 6 2根據(jù)外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA鑒定重組子 根據(jù)RT PCR擴(kuò)增片段鑒定重組子采用RNA分子雜交法鑒定重組子Northern印跡雜交法斑點(diǎn)印跡雜交菌落 或噬菌斑 原位雜交 基因工程2 6重組子的鑒定 1 Northern印跡雜交針對(duì)于RNA的雜交技術(shù)步驟與Southern印跡雜交基本相似 根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA鑒定 與Southern印跡雜交不同之處 RNA電泳避免單鏈RNA自身形成高級(jí)結(jié)構(gòu)和自身降解 變性凝膠電泳 甲醛 尿素 甲酰胺等 RNase抑制環(huán)境 根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA鑒定 2 RT PCR從轉(zhuǎn)化子中提取總RNA 以它為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 再進(jìn)行PCR擴(kuò)增 若獲得了特異的cDNA片段則證明是含有外源基因的重組子 2 6 3根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 酶 多肽鑒定重組子 蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定重組子單向凝膠電泳雙向凝膠電泳毛細(xì)管等電點(diǎn)凝膠電泳免疫檢測法鑒定重組子酶聯(lián)免疫吸附法Western印跡法固相放射免疫法免疫沉淀法質(zhì)譜分析法 基因工程2 6重組子的鑒定 酶標(biāo)儀 根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物鑒定 1 蛋白凝膠電泳法 基因工程2 6 3根據(jù)外源基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 酶 多肽鑒定重組子 基因工程2 6 3根據(jù)外源基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 酶 多肽鑒定重組子 2 免疫學(xué)檢測 1 免疫沉淀步驟靶細(xì)胞放射性標(biāo)記細(xì)胞裂解形成免疫復(fù)合物 A蛋白 sepharose回收靶蛋白的免疫沉淀電泳 放射自顯影 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA 是固