qRT PCR 生物分析檢測(cè)技術(shù)ppt課件

第二節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 技術(shù)原理及應(yīng)用 一 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀二 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理1 定量與常規(guī)的差別2 熒光擴(kuò)增曲線3 熒光閾值和CT值4 熔解曲線5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 6 何為實(shí)時(shí) 7 SYBRGreenI的工作原理8 MolecularBeacons 發(fā)夾型雜交探針 的工作原理9 TaqMan 水解型雜交探針 的工作原理10 多色多通道技術(shù)應(yīng)用 基因表達(dá)分析11 內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹三 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹1 醫(yī)療方面2 研究方面3 其它方面四 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單五 實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究 一 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熱循環(huán)儀 PCR儀 熒光檢測(cè)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)及軟件系統(tǒng) 不產(chǎn)熱的光源 發(fā)光二極管 LED 靈敏度高的檢測(cè)器 光電倍增管 PMT 優(yōu)點(diǎn) 不產(chǎn)熱 無散熱裝置 全封閉無機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)裝置 抗震性強(qiáng)無需經(jīng)常校準(zhǔn) 耐用靈敏度高線性范圍廣 Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀光色 藍(lán)色光均一性 0 4 C染料 FAM SYBRGreenI MolecularbeaconsTaqManProbes精確性 0 3 C激發(fā)光波長 450 495nm發(fā)射光波長 515 545nm升降溫速率 最高3 C 秒 靈敏度 5nM的熒光素溫度梯度 有檢測(cè)范圍 100 108拷貝容量 96樣品反應(yīng)管 0 2mL反應(yīng)管 96孔板操作系統(tǒng) WindowsNT 二 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理 1 定量與常規(guī)的差別常規(guī)PCR技術(shù) 對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù) 對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析 SYBRGreenI定量原理確定初始模板的濃度 初始DNA量越多 熒光達(dá)到某一值 域值 時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 其反應(yīng)體系中 引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì) 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行 PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì) 熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加 每經(jīng)過一個(gè)循環(huán) 收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào) 這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化 從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線 2 熒光擴(kuò)增曲線熒光擴(kuò)增曲線可以分三個(gè)階段 熒光背景信號(hào)階段 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期 熒光背景信號(hào)階段 擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋 我們無法判斷產(chǎn)物量的變化 平臺(tái)期 擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加 PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系 所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù) 只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段 PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系 我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析 3 熒光閾值和CT值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值 它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上 但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 熒光閾值線的位置一般事實(shí)上位于減去本底的位置上 這時(shí)的熒光信號(hào)超過了熒光背景信號(hào)并且開始增加 對(duì)某一樣品的C t 值就定義為熒光量與熒光閾值線交叉時(shí)的循環(huán)數(shù) 即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值 thresholdvalue 定量熒光擴(kuò)增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表 4 熔解曲線在PCR結(jié)束后 我們可以根據(jù)變性過程中的熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線 繪制熔解曲線時(shí) Real TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對(duì)到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化過程 不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈 當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí) SYBRGreen 的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測(cè)到 由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖 熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn) 熔點(diǎn) Tm 即為熔解峰值 熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑 當(dāng)圖中沒有出現(xiàn)雜峰 也未出現(xiàn)主峰的異常增寬 表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增 5 標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值與起始模板的關(guān)系研究表明 每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 起始拷貝數(shù)越多 CT值越小 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 其中橫坐標(biāo)代表CT值 縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù) 如圖3所示 因些只要獲得未知樣品的CT值 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù) Thistechnologyisverysensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable Quantitationcanbe relative toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene or absolute whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations 6 何為實(shí)時(shí) 試劑方面 如何做到相對(duì)熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是PCR產(chǎn)物的相對(duì)量 如何做到相對(duì)熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是特定PCR產(chǎn)物的相對(duì)量 儀器方面 如何測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度Opticon實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)PCR儀試劑工作原理工作原理哪一步可以觀察到熒光信號(hào) 變性 復(fù)性 延伸應(yīng)用 7 SYBRGreenI的工作原理SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部SYBRGreenI染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 SYBRGreen 的最大吸收波長約為497nm 發(fā)射波長最大約為520nm 在PCR反應(yīng)體系中 加入過量SYBR熒光染料 SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后 發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào) 而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微弱熒光信號(hào)背景 從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步 變性 無熒光信號(hào) 未結(jié)合SYBRGreenIDye通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物 SYBRGreen 的特點(diǎn)由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合 不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制 因此通用性好 且價(jià)格相對(duì)較低 利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì) 通過熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體 因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增 此外 由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)分子的染料結(jié)合 因此SYBRGreen 的檢測(cè)靈敏度很高 但是 由于SYBRGreen 與所有的雙鏈DNA相結(jié)合 因此由引物二聚體 單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性 通過測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響 由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析SYBRGreenI CYBRGreenI的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)起始模板濃度定量融解曲線分析 可區(qū)分單一產(chǎn)物 變異產(chǎn)物 多種產(chǎn)物和 或 引物二聚體基因型分析使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物沒有序列特異性 可以用于不同的模板便宜靈敏與非特異性產(chǎn)物結(jié)合 MolecularBeacons 發(fā)夾型雜交探針 的工作原理原理 熒光諧振能量傳遞 FRET 環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成變性 產(chǎn)生非特異性的熒光延伸 沒有熒光 分子Beacons是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針 在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中 位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近 在此結(jié)構(gòu)中 熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子 而是將能量傳遞給淬滅劑 這一過程稱為熒光諧振能量傳遞 FRET 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu) 是一個(gè)具有莖 環(huán) loop stem 結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針 通常有25 35個(gè)核苷酸 兩端分別標(biāo)上一個(gè)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中 環(huán)的部分用于與靶序列雜交 與目標(biāo)序列互補(bǔ) 通常由15 30個(gè)核苷酸組成 要求與靶序列雜交后能形成與探針 靶序列雙螺旋有關(guān)的反式構(gòu)型 并使干的部分打開 盡量得使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開足夠的距離 一般莖 干的部分 一般5 8個(gè)核苷酸長 堿基對(duì) 并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu) 熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端 一般連在5 端 而淬滅基團(tuán)一般連在3 端 通常用4 4 二甲基氨基偶氮苯基 苯甲酸 DABCYL 作為淬滅基團(tuán) 分子Beacons必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì) 以致于在復(fù)性溫度下 模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 模板存在時(shí)則與模板配對(duì) 自由狀態(tài)時(shí) 分子信標(biāo)呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu) 熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠得很近 二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移 FRET和直接能量轉(zhuǎn)移 熒光基團(tuán)的能量被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā) 熒光幾乎完全被猝滅 當(dāng)有靶序列存在的時(shí)候 靶序列和分子信標(biāo)的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu) 導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象改變 干的部分打開 熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開 二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止 在有相應(yīng)的單色光激活時(shí) 熒光基團(tuán)發(fā)出熒光 熒光強(qiáng)度與溶液中靶序列的多少成正比 通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度就可以計(jì)算出靶序列的量 Beacons與模板配對(duì)后 分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開 當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí) 它發(fā)出自身波長的光子 分子Beacons不同于SYBRGreen的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它特異性地檢測(cè)感興趣的目標(biāo)DNA 通過精心設(shè)計(jì)分子Beacons和優(yōu)化反應(yīng)條件 溫度和緩沖液 后 其靈敏度非常高 可用于單核苷酸多態(tài)性 SNPs 的檢測(cè) 但是 為檢測(cè)某一特定的目標(biāo)DNA 每一個(gè)探針都必須單獨(dú)仔細(xì)地設(shè)計(jì) 分子Beacons是美國紐約公共健康研究學(xué)會(huì)的技術(shù)專利 MolecularBeacons的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性 SNP 檢測(cè)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一熒光背景低設(shè)計(jì)困難無終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高 9 TaqMan 水解型雜交探針 的工作原理目標(biāo)特異性探針5 為熒光素 3 為淬滅劑模板和探針雜交延伸 聚合反應(yīng) Taq酶切下5 端熒光素出現(xiàn)熒光 TaqMan 水解型雜交探針 的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定SNP分析對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 特別適合于SNP檢測(cè)與MolecularBeacons相比 設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單價(jià)格較高只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)不能進(jìn)行融解曲線分析 QuantitativeReal TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin Elmer AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetectorDeborahS GroveNucleicAcidFacility LifeScienceConsortium ThePennsylvaniaStateUniversity UniversityPark PA16802 ProbeAprobe ie TaqMan isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforwardandreverseprimers Theprobeislabeledatthe5 endwithareporterfluorochrome usually6 carboxyfluorescein 6 FAM 6 羧基熒光素 andaquencherfluorochrome 6 carboxy tetramethyl rhodamine TAMRA 6 羧基 四甲基 若丹明 addedatanyTpositionoratthe3 end TheprobeisdesignedtohaveahigherTmthantheprimers andduringtheextensionphase theprobemustbe100 hybridizedforsuccessoftheassay PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter However asTaqpolymeraseextendstheprimer theintrinsic 內(nèi)在的 固有的 5 to3 nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe releasingthereporterfluorochrome Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle Fluorogenic5 nucleasechemistry 1 ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers 2 Asthepolymeraseextendstheprimer theprobeisdisplaced 3 Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe 4 Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher afluorescentsignalisgenerated ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle Ct TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable TheCtisinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate thehigherthetemplateconcentration thelowerthethresholdcyclemeasured Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction Thethresholdcycle Ct isshownbythedarkerhorizontalline AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct Turn aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequencespecificprobeisrequired Userswillalsoneedtopurchaseflat top opticalcapsor0 2mmthermalmicrosealfilmfortheirplates Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal timePCRareinnumerable 數(shù)不清的 DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription RT step SetupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironmentthantraditionalPCRtechniques Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle basenucleotidemutationsandpolymorphisms Allelic 等位基因的 discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch Oneprobelabeledwith6 FAM 6 羧基熒光素 representsoneallele 等位基因 andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele Amismatchleadstoalessefficientamplification Fluorescencespectraarecollectedaftertherun andusingmulticomponentanalysis thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal Heterozygotes 雜合子 showintermediateincreasesofFAMandVICsignals Allthreegroupsareclearlydistinguishable andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication 10 多色多通道技術(shù)應(yīng)用 基因表達(dá)分析 PRIMERANDPROBEDESIGNPrimersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5 and3 ends PE ABDPrimerExpresssoftware whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes Therequiredparametersforwell designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10 Chigherthantheprimers primerTmisbetween58 Cand60 C ampliconsizebetween50and150bases absenceof5 Gs Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase andtheprobesonlyhavetodifferbythatbase AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa probeless alternativetotheTaqMansystem Becauseitbindstoalldouble strandedDNA itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean singleproduct becauseanyprimer dimersorbackgroundsmearsaredetected Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe Iftheresultsaresatisfactory theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity 11 內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹 三 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹 熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用對(duì)DNA RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析 前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度 后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較 可以不定期對(duì)PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析如 利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體 以區(qū)分非特異擴(kuò)增 利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測(cè)等 目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究 臨床診斷 疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域 其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面 比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 如藥物處理 物理處理 化學(xué)處理等 及特定基因在不同相的表達(dá)差異 比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異 驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果 驗(yàn)證RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 四 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套 一次性吸水紙微量加樣器一套 覆蓋1 1000ul 以上物品各一套 2 8 和 20 或 80 冰箱混勻器耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭 帶濾心 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 五 實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究Microarray最強(qiáng)大的功能是平行分析 在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察上萬種RNA的相對(duì)量變 也因?yàn)槠叫刑幚碇?無法對(duì)每一個(gè)probe做最佳化 標(biāo)準(zhǔn)化 所以目前大部份結(jié)果都會(huì)再以NorthernblotorReal timequantitativePCR再做確認(rèn) 雖然Northernblot在過去曾扮演十分稱職的角色 但有時(shí)microarray篩選出來的基因常有上千個(gè)譜 以傳統(tǒng)方法來驗(yàn)證 仍是耗費(fèi)人力物力的苦差事 Real timequantitativePCR在近年來迅速普及 原因在其高靈敏度 快速及精確 樣品需求量少也是很重要的優(yōu)勢(shì) 是最適合承接microarray驗(yàn)證的工具 LaserCapturedMicrodissection LCM RealTimeQuantitativePCR 量化組織中特定基因之表現(xiàn)共聚焦顯微影像系統(tǒng) ConfocalImagingSystem 流速細(xì)胞篩選分析系統(tǒng) FlowCytometry 以上技術(shù)就基因表現(xiàn)之各個(gè)面相作系統(tǒng)探討 實(shí)驗(yàn)程序 舉例 RNA的定量 RNA的測(cè)量儀上 以NonoDrop軟件進(jìn)行RNA的定量 ng l 如濃度過高必須稀釋后再定量 以便定量盡可能地準(zhǔn)確 同時(shí) 可從260 280的比值看出RNA的純度 一般在1 9 2 1之間 是否在要求的范圍內(nèi) RNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA模板的稀釋 用作RNA反轉(zhuǎn)錄的RNA量 在鹽芥和擬南芥兩種材料 各200mMNaCl處理2小時(shí)及對(duì)照的4種RNA之間必須完全準(zhǔn)確一致 即Ara200 Ara0 Th200 Th0的RNA量均為2000ng 以下的反轉(zhuǎn)錄體系中RNA和RNase freeH2O的總體積為8 5 l RNA RNase freeH2O 8 5 l 2000ngRNA Oligo dT18 500ng l 0 5 ldNTP 2 5mM each 4 l計(jì) 13 l該體系于65 70 5min 置于冰上冷卻后 加下面反應(yīng)體系 5 RTBuffer 4 l0 1MDTT 2 lSuperScriptIIIRT 1 l總計(jì) 20 l混勻 50 保持6小時(shí)或過夜 即得到20 lcDNA 該cDNA稀釋20倍 即為400 l稀釋的cDNA 此用于實(shí)時(shí)定量PCR作為反應(yīng)模板 DTT即Dithiothreitol 中文名為二硫蘇糖醇 分子式為C4H10O2S2 是一種常用d的小分子有機(jī)還原劑 有抗氧化作用 二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖 一種四碳單糖 DTT的異構(gòu)體為Dithioerythritol DTE 即DTT的氧化結(jié)構(gòu) 實(shí)時(shí)定量PCR Real timePCR SYBR GreenPCRMasterMix 12 5 l稀釋的cDNA模板 2 lPrimer F 1 lPrimer R 1 l總計(jì) 25 l 2 CT方法與相對(duì)基因表達(dá)差異的分析使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對(duì)加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理 標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因 適合于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase actin 細(xì)胞骨架蛋白beta actin或beta tubulin 2 microglobulin 微球蛋白 以及rRNA 當(dāng)然 其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo) 我們?cè)趹?yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理的影響 相對(duì)定量的方法分析基因表達(dá)差異 i 選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因 ii 確定內(nèi)標(biāo)的有效性 確保它不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理的影響 iii 通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板 確保它們的擴(kuò)增效率相同 iv 最后通過2 CT計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始CT值 CT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異 2 CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法 Giovanna 2002 提出 相對(duì)CT 或 CT 的方法 這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要為每次實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 只需要一個(gè)優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的 至少是相似的反應(yīng)效率即可 比較CT方法的優(yōu)點(diǎn)是無需標(biāo)準(zhǔn)曲線 適合多個(gè)樣品 當(dāng)然它也消除了創(chuàng)造標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)任何稀釋錯(cuò)誤的不利影響 相比于標(biāo)準(zhǔn)子 normalizer 比較CT法 CT 在對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量 監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)水平時(shí) 不需標(biāo)準(zhǔn)曲線并增加了樣品的通量 為了使這個(gè)方法成功應(yīng)用 目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等 只要靶基因和標(biāo)準(zhǔn)者具有相似的動(dòng)力學(xué)范圍 比較CT CT 方法就是最具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的方法 2 CT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型 本實(shí)驗(yàn)中參照因子是未經(jīng)NaCl處理的對(duì)照樣品 內(nèi)標(biāo)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的看家基因Actin 根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)值 使用公式 1 9 CT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)基因在兩種處理情況下的表達(dá)水平均來自3次實(shí)時(shí)定量PCR的平均值 Ct ActinCt control Ct ActinCt 200mMNaCl處理 deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDev ThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia 缺氧癥 ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner IsabelleDupuis andCrisKuhlemeier InstituteofPlantSciences Altenbergrain21 CH 3013Berne SwitzerlandPlantPhysiology June2003 Vol 132 pp 968 978 www plantphysiol org 2003AmericanSocietyofPlantBiologists Fermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress Pyruvatedecarboxylase PDC 丙酮酸鹽 或酯 脫羧酶 whichcatalyzesthefirststepinthispathway isthoughttobethemainregulatoryenzyme PDCisencodedbyfourcloselyrelatedgenesinArabidopsis Usingreal timequantitativepolymerasechainreaction wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgeneindifferenttissues undernormalgrowthconditions andwhentheplantsweresubjectedtoanoxiaorotherenvironmentalstressconditions PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase ALDH genefamily Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia butALDH2B7reactsstronglytoABAapplicationanddehydration suggestingthatALDHmayplayaroleinaerobicdetoxificationofacetaldehyde Discussthepossibleroleofethanolicfermentationasarobustback upenergyproductionpathwayunderadverseconditionswhenmitochondrialfunctionisdisturbed Estimatingthecopynumberoftransgenesintransformedricebyreal timequantitativePCR YangL DingJ ZhangC JiaJ WengH LiuW ZhangD SchooloflifeScienceandBiotechnology ShanghaiJiaoTongUniversity 800DongchuanRoad Shanghai 200240 People sRepublicofChina PlantCellRep 2005Mar 23 10 11 759 63 Epub2004Oct1 Intransgenicplants transgenecopynumbercangreatlyinfluencetheexpressionlevelandgeneticstabilityofthetargetgene makingestimationoftransgenecopynumberanimportantareaofgeneticallymodified GM cropresearch TransgenecopynumbersarecurrentlyestimatedbySouthernanalysis whichislaboriousandtime consuming requiresrelativelylargeamountsofplantmaterialsandmayinvolvehazardousradioisotopes Reportherethedevelopmentofasensitive high throughputreal time RT PCRtechniqueforestimatingtransgenecopynumberinGMrice UseTaqManquantitativeRT PCRandcomparisontoanovelriceendogenousreferencegenecodingforsucrosephosphatesynthase SPS todeterminethecopynumbersoftheexogenousbeta glucuronidase GUS andhygromycinphosphotransferase HPT genesintransgenicrice ThecopynumbersoftheGUSandHPTinprimaryricetransformants T0 werecalculatedbycomparingquantitativePCRresultsoftheGUSandHPTgeneswiththoseoftheinternalstandard SPS WithoptimizedPCRconditions achievedsignificantlyaccurateestimatesofone two threeandfourtransgenecopiesintheT0transformants CopynumberestimationsofboththeGUSreportergeneandtheHPTselectivemarkergeneshowedthatrearrangementsoftheT DNAoccurredmorefrequentlythanisgenerallybelievedintransgenicrice Anexpressionanalysisofagenefamilyencodingplasmamembraneaquaporinsinresponsetoabiotics