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鹽析法純化血清中IgG類抗體 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握鹽析法提取血清免疫球蛋白IgG抗體的原理熟悉血清IgG提取純化操作過程和方法 2 二 實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對(duì)溶解度不同 它在一定濃度的中性鹽溶液中易于沉淀 而其他蛋白質(zhì)組分在此時(shí)不易沉淀 通過離心可將兩者分離 3 透析法脫鹽 透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜 玻璃紙 火綿紙等 制的透析袋里放在透析緩沖液中進(jìn)行 可不斷更換緩沖液 直至雜質(zhì)被除去 4 四 操作步驟 5 五 結(jié)果判斷 分別測(cè)OD280和OD260處的光密度值 按照公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度 mg ml 1 45OD280 0 74OD260IgG正常參考值 8 00 16 00g L效價(jià)可用免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)判斷 特異性則可通過雙擴(kuò) 免疫電泳或交叉凝集試驗(yàn)進(jìn)行考察 濃度也可通過免疫濁度法等檢測(cè) 6 六 注意事項(xiàng) 鹽的飽和度 影響鹽析的重要因素 不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同pH值 在等電點(diǎn)時(shí) 蛋白質(zhì)溶解度最小越易沉淀析出 蛋白質(zhì)濃度 越大越易沉淀 使用鹽的飽和度的極限愈低 過高也易引起其他雜蛋白共沉 溫度 一般可在室溫下進(jìn)行 某些對(duì)熱特別敏感的酶 則宜低溫 7 脫鹽 透析時(shí)間較長(zhǎng) 常在低溫下進(jìn)行 并加入防腐劑避免變性或微生物的污染 飽和硫酸銨溶液的滴加方式 逐滴 攪拌鹽析后放置時(shí)間 離心操作的速度 時(shí)間透析袋的使用 8 七 方法學(xué)評(píng)價(jià) 硫酸銨水中溶解度高 受溫度影響小 不易使蛋白質(zhì)變性 操作簡(jiǎn)單 為鹽析中常用的中性鹽硫酸銨中含有氮 會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定 且溶液的緩沖能力差 故多用于大量蛋白的粗提 若要獲得純化的免疫球蛋白 必須經(jīng)過凝膠過濾 離子交換層析

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