轉(zhuǎn)錄水平檢測甲胎蛋白

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 第四次討論課 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) AFP的來源及生化特性 AFP測定的臨床意義 從轉(zhuǎn)錄水平對AFP 甲胎蛋白 基因的表達(dá)進行檢測 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) AFP的來源及生化特性 甲種胎兒球蛋白 alpha fetoprotein或 fetoprotein AFP或afp AFP是嚙齒類動物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分 人類胚胎在宮內(nèi)發(fā)育的第六周左右用雙向擴散法即能測出AFP 到第13周左右可達(dá)到高峰 第16周后AFP的濃度迅速下降而白蛋白濃度上升 在人類胚胎中AFP最高濃度可達(dá)3 4mg ml 但新生兒期其血清濃度約為10 50ug ml 出生后第1周末用雙向擴散法即不再能測出 然而用敏感的方法測定 證明AFP可持續(xù)存在于正常成人的血清中 AFP的合成部位主要是在嚙齒動物及人類胚胎的肝臟 但也可在卵黃囊及胃腸道等 人類的AFP屬于 球蛋白 分子量約為64 000 72 000 此蛋白約有18種氨基酸組成 碳水化合物約占4 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) AFP測定的臨床意義 診斷原發(fā)性肝癌 檢測AFP的含量是診斷原發(fā)性肝癌的重要手段之一 由于肝癌的癌細(xì)胞能合成或分泌較多的AFP釋放入血的緣故 正因為如此 醫(yī)生們就把檢測人體血液中的AFP作為診斷肝癌的重要依據(jù) 并把AFP稱為 肝癌標(biāo)志物 檢測AFP是診斷肝癌的一種簡便 靈敏 快捷的方法 現(xiàn)認(rèn)為它在發(fā)現(xiàn)早期肝癌方面有獨一無二的價值 用AFP診斷肝癌的 專一性 僅次于病理學(xué)檢查 血清AFP升高 還可出現(xiàn)于畸胎瘤 睪丸和卵巢腫瘤等 急性肝炎和肝硬化的鑒別診斷肝細(xì)胞再生時期 AFP在血液中呈陽性 急 慢性肝炎 肝硬化時會有肝細(xì)胞再生 因而AFP在血液中的濃度升高 一般急性肝病 可隨病情好轉(zhuǎn)AFP含量下降或正常 肝硬化可呈下降或持續(xù)低水平 肝癌則逐漸上升 先天性疾病的診斷先天性疾病的診斷 檢測羊水中AFP含量的意義已引起注意 Rendle用放射免疫法檢測 發(fā)現(xiàn)無腦兒羊水中含量顯著升高 正常妊娠12 16周羊水AFP含量為21 1 1 2mg L 以后逐月下降 足月時為0 5 0 2mg L 無腦兒患者在妊娠26 31周為95 7 19 3mg L 32 38周為25 7 5 9mg L 先天性腎病及脊柱裂也有類似報道 因此用放免法檢測羊水中AFP含量 有助于某些先天性疾病的出生前診斷 母體血中AFP升高還可見于異常妊娠 如 胎兒有脊柱裂 無腦兒 腦積水 十二脂腸和食道閉鎖 腎變性 胎兒宮內(nèi)窒息 先兆流產(chǎn)和雙胎等 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 甲胎蛋白基因 alpha fetoprotein AFP 的異常表達(dá)與肝癌 前列腺癌等惡性腫瘤有關(guān) 01 02 03 04 實驗?zāi)康?實驗方法及原理 技術(shù)路線 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 從轉(zhuǎn)錄水平對AFP 甲胎蛋白 基因的表達(dá)進行檢測 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 肝癌細(xì)胞的血源性播散是原發(fā)性肝癌肝外轉(zhuǎn)移的主要方式 定量檢測AFP alpha fetoprotein mRNA可早期發(fā)現(xiàn)外周血的肝癌細(xì)胞 不僅對判斷肝癌的轉(zhuǎn)移 復(fù)發(fā)具有重要價值 而且對指導(dǎo)臨床制定治療措施亦有重要意義 通過提取肝癌病人的外周血 根據(jù)mRNA豐度的測定方法 從轉(zhuǎn)錄水平對AFP 甲胎蛋白 基因的表達(dá)進行檢測 取材 肝癌患者外周血 用健康志愿者與非癌性肝病患者作為對照組 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 通過細(xì)胞RNA提取技術(shù) 然后通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 利用實時熒光定量PCR技術(shù) 測定AFPmRNA的豐度 實時熒光定量PCR QuantitativeReal timePCR 是一種在DNA擴增反應(yīng)中 以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法 Real timePCR是在PCR擴增過程中 通過熒光信號 對PCR進程進行實時檢測 由于在PCR擴增的指數(shù)時期 模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系 通過內(nèi)參或者外參法可對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 一 實時熒光定量PCR FQ PCR 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 熒光基團通常各有單一的的光吸收峰 熒光基團吸收激發(fā)光的能量后通常以3種方式釋放出能量 1 光能 2 熱能 3 轉(zhuǎn)移給鄰近的分子 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 當(dāng)某個熒光基團的發(fā)射光譜與另一個熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊 且兩個基團距離足夠近時 能量可以從短波長 高能量 的熒光基團傳遞到長波長 低能量 的熒光基團 實際相當(dāng)于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽 猝滅 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 熒光PCR的獨特之處在于PCR過程中利用熒光染料在激發(fā)光下釋放的熒光能量的變化直接反應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物量的變化 由于熒光信號變量與擴增產(chǎn)物變量成正比 通過足夠靈敏的自動化儀器對熒光進行采集和分析 能夠?qū)崿F(xiàn)對PCR過程的檢測 達(dá)到對原始模板定量的目的 主要采用以下數(shù)種模式 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 1 幾個基本概念 01 02 03 04 基線 熒光閾值的設(shè)定 Ct值 05 S型擴增曲線 熔解曲線 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里 熒光信號變化不大 接近一條直線 這樣的直線即是基線 一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號 本底信號是指沒有進樣時檢測器的信號值 與檢測器的類型有關(guān) 是無論如何也去不掉的值 測試的結(jié)果是在本底值之上增加多少的 熒光域值是PCR3 15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍 熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期 基線 熒光閾值的設(shè)定 C代表循環(huán)數(shù) t代表域值 Ct值的含義是 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 而所涉閾值都很低 Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析 由于是低濃度 影響因素小 誤差沒有被放大 所以具有良好的重現(xiàn)性 Ct值 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 PCR過程中 以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo) 以反應(yīng)過程中實時熒光強度為縱坐標(biāo)所作的曲線 S型擴增曲線 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 Ct與起始模板量的對數(shù)呈反比 即Y aX b 其中X為濃度值對數(shù)值 Y為Ct值 PCR擴增包含定量對照 即引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時進行擴增 配合使用PCR擴增與熒光檢測合二為一的儀器 利用該系列模板Ct值與已知濃度對數(shù)作直線回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 從而計算出位置樣品的起始模板濃度 這種定量分析摒棄對PCR終產(chǎn)物的測定 通過監(jiān)測PCR過程中熒光強度的連續(xù)變化 用準(zhǔn)確表征PCR對數(shù)增長規(guī)律的Ct值進行循環(huán)實時分析 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 固定循環(huán)數(shù)后 熒光信號與模板數(shù)成正比 但當(dāng)固定熒光信號值后 模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)呈反比 研究表明 每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系 起始拷貝數(shù)越多 Ct值越小 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線 橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù) 縱坐標(biāo)代表Ct值 因此 只要獲得位置樣品的Ct值 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù) 起始拷貝數(shù)就是指某基因 可以是質(zhì)粒 在某一生物的基因組中的個數(shù) 單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個 多則指有多個 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 熒光PCR融匯了PCR的靈敏性 DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)的定量精確性 具有以下的優(yōu)點 優(yōu)點 1 封閉反應(yīng) 直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果 污染因素少 且無需PCR后處理 2 靈敏度高 假陽性率低 熒光標(biāo)記探針的最大優(yōu)點在于其特異性非常強 避免了非特異性擴增造成的假陽性信號 3 采用對數(shù)期分析 摒棄終點數(shù)據(jù) 定量準(zhǔn)確 7 操作安全快速 4 定量范圍寬 可達(dá)到10個數(shù)量級 5 計算機同步跟蹤 數(shù)據(jù)化自動處理 在線實時監(jiān)測 結(jié)果直觀 避免人為判斷 8 利與自動化和聯(lián)網(wǎng)管理 6 效率高 可用多種商品畫熒光物質(zhì) 如TET FAM HEX JOE等作為報告熒光 3 端的猝滅基團常用TAMRA 實現(xiàn)一管雙檢或多檢 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 擴增的循環(huán)數(shù)越靠后 定量的重復(fù)性越差 可能有以下主要原因 1 熒光定量技術(shù)要求在低分子濃度環(huán)境 因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立起來的 如果分子濃度過高 影響作用復(fù)雜 而PCR擴增產(chǎn)物時高濃度的 因此重復(fù)性變差也很容易理解 2 由于擴增末期 擴增效率可能因為大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響 缺點 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 二 TaKaRaOneStepSYBRQRT PCR試劑盒 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 技術(shù)路線 實驗方法及原理 實驗?zāi)康?可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 原理 本制品利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptRTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 在以cDNA為模板利用TaKaRaExTaqHS在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進行RT PCR擴增反應(yīng) 利用SYBRGreenI嵌合熒光法 采用如圖所示的OneStepRT PCR方法 反轉(zhuǎn)錄以總RNA為模板 利用反應(yīng)引物合成cDNA 在以此為模板 利用引物進行PCR擴增反應(yīng) 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 用TRIzol試劑盒提取RNATRIzol是一種新型總RNA抽提試劑 可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA 其含有苯酚 異硫氰酸胍等物質(zhì) 能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 引物 探針的設(shè)計和合成 應(yīng)用生物信息學(xué)知識 從基因庫中查閱出AFP的DNA和mRNA序列 根據(jù)引物設(shè)計原則 并利用PrimerExpress2 0設(shè)計軟件 設(shè)計出擴增AFPmRNA基因片段的上下游引物和探針 PCR實驗成功的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是引物的設(shè)計 甲胎蛋白DNA序列 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 引物 探針的設(shè)計和合成 上游引物序列 5 TGGGACCCGAACTTTCCAAG 3 下游引物序列 5 CCTGCAGACAATCCAGCACAT 3 探針序列 5 TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT 3 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 RT PCR擴增AFPmRNA 用上述提取的的總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)體系 主要包含上下游引物 各種酶 底物 模板和Mg2 5種物質(zhì) 現(xiàn)在以TaKaRaOneStepSYBRQRT PCR試劑盒為例作為整個反應(yīng)體系 反應(yīng)條件 針對不同的引物 設(shè)定最佳的退火溫度是QRT PCR反應(yīng)順利進行的關(guān)鍵 具體反應(yīng)程序包括反轉(zhuǎn)錄 預(yù)變性 變形 退火 延伸等 所有過程的反應(yīng)溫度和作用時間均應(yīng)經(jīng)過篩選確定最佳反應(yīng)條件 具體反應(yīng)條件的參考值見表1 可在參考值范圍內(nèi)加減選擇最佳條件 根據(jù)擴增片段長度 擴增產(chǎn)物用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳 在紫外燈下割取特異性的條帶 用QIAquickGelExtractionKit 德國Qiagen公司 試劑盒 用于純化DNA 進行純化 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用RNaseFreedH2O 用于溶解難溶于水的RNA 將總RNA稀釋到0 2 g l 作為濃度最高的模板 20 1號 然后取11個容量為150 l的離心管 2 12號 分別加入10 lRNaseFreedH2O 從1號管中取10 l加到2號管中 稀釋倍數(shù)為1 以此類推 如圖所示 將1號主機2倍稀釋成 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 2 11 用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將倍比稀釋的總RNA作為QRT PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板 應(yīng)用確定的最佳反應(yīng)條件 進行實時熒光定量PCR擴增 系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律生成標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線 熔解曲線 和標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 熔解曲線上應(yīng)該有且只有一個明顯的峰 擴增產(chǎn)物的Tm值須非常均一 表明沒有產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物及引物二聚體 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 實驗?zāi)康?技術(shù)路線 實驗方法及原理 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)