-基因工程的基本操作程序

.,姐的心里不缺人不死唐三藏-高調艿是姐的風格、黑的不是社會，是心。勞資就是不淑女#奈何橋上唱征服飛車妹子雄起無敵硬妹拒絕狗友媳婦為王姐我輸?shù)钠?。你若離去丶巴掌扇去*我天生傲骨怎能服輸哥不會英文，只會拼音一槍崩了你。帆布鞋也比你高跟鞋優(yōu)雅、未來學霸命你！我素學渣我怕誰甩我者亡i婷大爺傷我者亡墳地里唱嗨歌別碰我心#歐霸！時賤去尼瑪淑女少年就要狂我要當學霸、我行我素。寧無愛哥丶看破繁華說我拽你能奈我何愛滾哪滾哪！你快滾！傷我你不配&你拿什么資本跟我傲！|你特么算什么東西不過如此你已被我out冥花有主絕誘惑矯揉造作無需挽留莫犯賤。_愛你等于作孽窮的只有愛、sorry請滾。氣勢比天高大陸男神勞資是個好菇涼國產好姑娘*Rollforme給我滾國際帥鍋丶直覺不是理由抱歉。nl、不配若離，必棄。男人拽照樣甩變態(tài)人士強迫癥患者補刀團團長你柔弱給誰看莫裝純午夜埋葬者霸道姐騷娘們勞資愛上尼瑪了姐不缺愛,1.2基因工程的基本操作程序,.,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用,載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。,才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。,.,一、目的基因的獲取,.,1.從基因文庫中獲取目的基因,1.基因文庫的概念:,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。,2.基因文庫的種類:,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫,某生物體內全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,與運載體連接導入,基因組文庫,cDNA,受體菌群體,與運載體連接導入,cDNA文庫,某種生物某個時期的mRNA,.,基因的結構,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),RNA聚合酶結合位點,外顯子,內含子,終止子,啟動子,原核,真核,.,原核細胞的基因結構,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,不編碼蛋白質。,：編碼蛋白質,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),調控遺傳信息表達,上游的RNA聚合酶結合位點:,基因結構,.,真核細胞的基因結構,編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),內含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列,：有調控作用,上游有RNA聚合酶結合位點(啟動子)。,與RNA聚合酶結合位點,基因結構,.,原核細胞與真核細胞的基因結構比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,轉錄,翻譯,轉錄,翻譯,.,基因文庫的構建方法,基因組文庫的構建,提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼该盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組載體,基因組文庫,導入受體菌中儲存,.,cDNA文庫的構建-逆轉錄法：,提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體連接,cDNA文庫,反（逆）轉錄酶,DNA聚合酶,導入受體菌中儲存,.,思考？,真核生物的基因用逆轉錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？,.,真核細胞的cDNA的獲取,編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),DNA聚合酶,剪接有關的酶,RNA聚合酶,mRNA前體,mRNA,單鏈DNA,cDNA,逆轉錄酶,轉錄,剪接,逆轉錄,復制,啟動子,終止子,基因,不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內含子,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,2.利用PCR技術擴增目的基因,多聚酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,.,PCR技術的操作過程,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,d.重復a.b.c步驟：每重復一次，目的基因增加_倍,一,.,PCR技術的操作過程,.,PCR技術的操作過程,PCR反應體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增,.,PCR技術擴增與DNA復制的比較,堿基互補配對原則,堿基互補配對原則,四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP,四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化解旋,半保留復制、邊解旋邊復制,半保留復制、全解旋再復制,體外復制,主要在細胞核內,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內的DNA聚合酶、解旋酶等,.,3.人工合成法,在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成,蛋白質的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化學合成,推測,推測,思考：化學法合成的目的基因含內含子、啟動子和終止子嗎？,.,人工合成法（真核生物）,反轉錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推測,推測,單鏈DNA,合成,.,課堂小結,目的基因的獲取,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術擴增,3、人工合成,種類,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,.,二、基因表達載體的構建基因工程的核心,.,表達載體,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,.,基因表達載體的構建過程,質粒,DNA分子,限制酶處理,兩個切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質粒）,同一種,一個切口兩個黏性末端,.,注意：,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,.,三、將目的基因導入受體細胞,.,1、目的基因導入植物細胞的方法,（1）農桿菌轉化法,農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。,原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,.,三、目的基因導入受體細胞,構建基因表達載體,轉入,農桿菌,植物細胞,導入,穩(wěn)定維持和表達,過程：,.,1、目的基因導入植物細胞的方法,（2）基因槍法：目的基因導入單子葉植物細胞,操作方法：利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。,鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um。,適用：單子葉植物,.,1、目的基因導入植物細胞的方法,（3）花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞,特點:十分簡便經濟。,例：轉基因抗蟲棉,.,2、將目的基因導入動物細胞,方法：顯微注射法,程序,目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物,.,3、將目的基因導入微生物細胞,微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細胞,感受態(tài)細胞吸收DNA,表達載體與感受態(tài)細胞混合,.,小結：將目的基因導入受體細胞,.,四、目的基因的檢測與鑒定,導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？,1,真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。,2,目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？,不一定，需要檢測,.,1、鑒定分子水平的鑒定,轉基因生物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,基因探針：,放射性同位素等標記的DNA分子,方法,DNA分子雜交技術,變性,變性,.,1、鑒定分子水平的鑒定,變性,方法,分子雜交技術,（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉基因生物的mRNA,14N,14N,.,1、鑒定分子水平的鑒定,提取,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內,從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質,出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),.,2、鑒定個體水平的鑒定,抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。,.,思考？,不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。,受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？,.,課堂練習,1、有關基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內切酶,A,.,課堂練習,2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()利用mRNA反轉錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取利用PCR技術利用DNA轉錄人工合成A.B.C.D.,D,.,課堂練習,3、有關基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質粒的形成在細胞內完成C、質粒都可作為運載體D、蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,D,【拓展深化】工具酶只有兩種：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一種，目的是產生相同的黏性末端；DNA連接酶只在操作程序2中用到。,.,課堂練習,4、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運載體結合C、將目的基因