熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)分析ppt課件.ppt

熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)分析與常見問題解決,技術支持黃志,內容,LifeTechnologies公司定量PCR儀產品概覽熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR實驗常見問題的解決,AB熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史,1995世界上第一臺定量PCR儀-7700型誕生1997推出面向醫(yī)療系統(tǒng)用戶的5700型定量PCR儀2000推出7900型384孔定量PCR儀2001推出7900型96孔定量PCR儀2001推出7000型96孔定量PCR儀2004獲得定量PCR儀專利確立AB在業(yè)界內的領先地位2004第5代定量PCR儀73007500型誕生第6代定量PCR儀StepOne和StepOnePlus問世第7代定量PCR儀ViiA7發(fā)布最新熒光定量PCR儀QuantStudio12KFlex發(fā)布,AB熒光定量PCR儀家族,第一、二代77005700,第三、四代70007900,第五代73007500,第六代stepone/plus,第七代ViiA7,最新型QuantStudio,熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)分析,熒光PCR實驗結果的分析流程,查驗擴增曲線,檢查/調整基線,檢查/調整閾值,檢查NTC,檢查陽性對照,檢查陰性對照,分析樣品數(shù)據(jù),基線與閾值線的設置,一般情況下選擇軟件默認的“自動設置”；特殊情況下或必要時，可以手動設置；手動設置的原則請查詢“DataAnalysisontheABIPRISM7700SequenceDetectionSystem:SettingBaselinesandThresholds:Guide:RevA”，文件號：4370923。,基線的設定,系統(tǒng)背景信號，在扣除背景過程中影響擴增信號的數(shù)值，最終影響Ct值。默認自動分析，比如設定在“3-15”個循環(huán)。手動設置時要避開前期的熒光波動與后期的擴增信號。必要時可以獨立設定制定樣品的基線取值范圍（V2.0）。,閾值線的設定,默認設定為同類擴增基線信號標準差的10倍，反映擴增信號具有統(tǒng)計學顯著的意義。不同擴增子應當獨立設定閾值線。手動設置在“指數(shù)擴增期”，避開前期的背景熒光波動與后期的非指數(shù)擴增及陰性對照最高點。對于絕對定量實驗，閾值線設定在使得標準曲線的決定系數(shù)值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。對于無標準曲線的實驗，閾值線設定在使得重復樣品Ct值差異最小的位置。閾值線設定在保障靈敏度均為最佳的位置,實驗結果的考評指標,定性實驗：是否為顯著的“S型”擴增曲線擴增曲線的“高度”-表示體現(xiàn)擴增性能的“強度”陽性對照的Ct值是否在“預期”的位置：過早污染或加樣錯誤過晚存在抑制劑或擴增體系條件不佳陰性對照是否報告Ct值污染、探針特異性差、閾值線設定過低,絕對定量實驗：標準曲線的斜率或擴增效率標準曲線的決定系數(shù)值：R2檢測樣品是否偏離標準曲線重復樣品Ct值的標準差,絕對定量實驗效果的評估,CT=klgX0+b,CT2CT1=（klgX02+b）（klgX01+b）,CT2CT1=k(lgX02lgX01),CT2CT1=klg(X02/X01),當擴增效率為100時，K=-3.32，若CT相差1，則兩個樣品的濃度差異為：,lg(X02/X01)=(CT2CT1)/k,當擴增效率為100時，K=-3.32，兩個樣品的濃度差異為10倍，則CT差異為：,CT值差與模板量差的關系,濃度增加1倍，CT值減小1個單位,濃度增加10倍，CT值減小3.3個單位,熒光定量PCR實驗常見問題,病原體核酸檢測效果的主要影響因素,樣品采集和儲運,核酸抽提,核酸定量檢測,采樣部位、保存液、凍融,導致巨大差別的因素,導致一般差別的因素,交叉污染、抑制劑、病毒裂解,引物、探針設計/合成質量核酸的純度和完整性預混液的質量,樣品量,樣品量、回收率,儀器、循環(huán)條件,實驗污染反應試劑質量問題未正確密封而導致的試劑蒸發(fā)錯誤的熒光染料設置錯誤的反應程序設置使用錯誤的耗材熒光污染儀器硬件問題,導致異常實驗數(shù)據(jù)的常見原因:,兩種容易混淆的陰性對照,無模板的陰性對照在反應體系中不加入核酸模板，而以水為替代的對照目的：監(jiān)控配制反應體系的試劑是否存在污染。陰性樣品的對照在樣品制備過程中，加入已知的陰性樣品（或水），并將提取物作為模板加入反應體系，參與整個實驗過程。目的：監(jiān)控整個實驗操作過程中是否存在污染。,故障排除時提供有用信息的軟件界面,原始熒光組分曲線-v2.0,擴增曲線-v2.0,標準曲線-v2.0,原始多通道熒光信號-v2.0,原始多通道熒光信號-v2.0,質控報告-V2.0,理想的實驗結果,案例1:是否存在擴增？,一些形狀和正常的擴增曲線有區(qū)別的曲線，該如何判斷呢？,正常的擴增曲線,平臺期很低,可疑的擴增曲線,這些曲線都有典型的指數(shù)增長期，而且和其他的曲線平行（雖然比較短）。,如何判斷它們是真正的擴增？,同時也具有特征性的三個增長階段。,如何判斷它們是真正的擴增？,可能是目標模板的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低,反應體系會形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴增曲線的平臺期很低。,是什么原因造成平臺期很低?,案例2:是否存在擴增？,?,如何判斷它們是否存在擴增？,首先，和同一反應中的其他擴增曲線相比，這些曲線的形狀不相同。,同時，這些曲線都沒有明顯的指數(shù)增長期。,如何判斷它們是否存在擴增？,其次，看Y軸的數(shù)值。這些“可疑”曲線的指數(shù)增長期范圍常常是落在1e-2的范圍內。,對數(shù)圖,如何判斷它們是否存在擴增？,最后，查閱線性圖：曲線一直沒有指數(shù)上升的趨勢，提示不存在擴增。輕微的熒光增長可能來源于探針的降解。,如何判斷它們是否存在擴增？,案例3:是否存在擴增？,右側的曲線形狀和擴增曲線很相似，但是曲線不光滑。,切換到線性圖，可以看到曲線有一定的上升。,如何判斷它們是否存在擴增？,分析,這些樣品在反應的最后階段才開始擴增，平臺期很接近背景。這些樣品的擴增曲線出現(xiàn)了指數(shù)擴增的區(qū)段雖然我們可以認為這些樣品是臨界陽性，但是對這些樣品的定量結果都是不太準確的。形成這類曲線的原因可能是模板的質量差(RT/PCR抑制物;模板濃度低)，也可能是引物探針的設計問題。試劑原因如果使用的試劑背景信號太強，熒光的增長將會很小，導致擴增曲線的指數(shù)增長期會變得很短，或者沒有。熒光信號差的試劑也會有同樣的問題。,總結：遵循擴增曲線形態(tài)第一，Ct值第二的判讀原則。,查看MultiComponentPlot：是否有正常的陽性擴增曲線查看擴增曲線的形狀：是否有明顯擴增階段（指數(shù)增長期）?指數(shù)圖下擴增曲線間是否平行