分析化學(xué) 第十一章 熒光分析法..ppt

第十一章熒光分析法,本章基本要求：理解分子熒光的基本原理；理解分子熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜的含義；掌握分子熒光發(fā)射光譜的特征；了解熒光光譜儀的組成及部分作用；掌握熒光分析法的主要應(yīng)用范圍。,第一節(jié)熒光分析法的基本原理,一、分子熒光分子熒光的產(chǎn)生分子吸收電磁輻射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程。一般用Jablonski能級(jí)圖來定性描述分子吸收和發(fā)射過程。分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程物質(zhì)的分子體系中存在著電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。由于一般的光譜儀器分辨不出轉(zhuǎn)動(dòng)能量，因而Jablonski能級(jí)圖中未畫出轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。,若分子的電子數(shù)是偶數(shù)，則分子中電子凈的自旋之和為S=0，即基態(tài)分子的電子是自旋成對(duì)的。由分子多重性的定義有M=2S+1=1,稱之為單重態(tài)。基態(tài)單重態(tài)以S0表示，S1和S2則分別代表分子的第一和第二激發(fā)單重態(tài)。當(dāng)分子處于激發(fā)態(tài)時(shí)，若分子的電子自旋與基態(tài)相同，仍然是單重態(tài)，即分子處于S1和S2。,在激發(fā)態(tài)中，分子的某個(gè)電子也有可能改變自旋，即自旋平行則S=1，所以多重性M=2S+1=3,分子處于這樣的激發(fā)態(tài)稱為三重態(tài)，圖中最低三重態(tài)以符號(hào)T1表示，T2代表較高的激發(fā)三重態(tài)。由于自旋平行比自旋配對(duì)的狀態(tài)更穩(wěn)定，故三重態(tài)的能級(jí)比單重態(tài)的能量略低。每個(gè)電子能級(jí)都有多個(gè)振動(dòng)能級(jí)，在同一個(gè)電子能級(jí)中，最低的線代表該能級(jí)的振動(dòng)基態(tài)。吸收過程發(fā)生在10-15s左右的時(shí)間內(nèi)。,分子吸收和發(fā)射過程的Jablonski能級(jí)能級(jí)圖,S0,3210,3210,T2,S1,3210,21043210,S2,T1,1234吸收吸收熒光磷光,分子的去激發(fā)過程,分子被激發(fā)到較高的能級(jí)后不穩(wěn)定，將以不同途徑釋放多余的能量回到基態(tài)，該過程為分子的去激發(fā)過程。去激發(fā)包括下面幾個(gè)可能的途徑。振動(dòng)弛豫在凝聚相體系中，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)的分子通過與溶劑分子的碰撞迅速以熱的形式把多余的振動(dòng)能量傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)，這一過程稱為振動(dòng)弛豫。振動(dòng)弛豫過程發(fā)生大約為10-12s。,內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換,當(dāng)S2的較低振動(dòng)能級(jí)與S1的較高振動(dòng)能級(jí)的能量相當(dāng)或重疊時(shí)，分子有可能從S2的振動(dòng)能級(jí)以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動(dòng)能級(jí)上該過程為內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換。內(nèi)轉(zhuǎn)換發(fā)生的時(shí)間約為10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換過程同樣也發(fā)生在激發(fā)三重態(tài)的電子能級(jí)間。,由于振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過程極為迅速(10-12s),因此，激發(fā)后的分子很快回到第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)。所以高于第一激發(fā)態(tài)的熒光發(fā)射十分少見。,熒光發(fā)射,當(dāng)分子處于第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)時(shí)，分子可能通過發(fā)射光子躍遷回到基態(tài)S0的各振動(dòng)能級(jí)上，這個(gè)過程稱為熒光發(fā)射。熒光發(fā)射過程約為10-8s.外部能量轉(zhuǎn)換激發(fā)態(tài)分子與溶劑和其它溶質(zhì)分子間的相互作用及能量轉(zhuǎn)換等過程稱為外部能量轉(zhuǎn)換。外轉(zhuǎn)換過程是熒光或磷光的競(jìng)爭(zhēng)過程，因該過程發(fā)光強(qiáng)度減弱或消失，該現(xiàn)象稱為“猝滅”或“熄滅”。,體系間跨越,系間躍遷是不同多重態(tài)之間的一種無輻射躍遷該過程是激發(fā)態(tài)電子改變其自旋態(tài)，是分子的多重性發(fā)生變化的結(jié)果。當(dāng)兩種能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí)，這種躍遷的幾率增大。S1T1即是單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷，即較低單重態(tài)振動(dòng)能級(jí)與較高的三重態(tài)振動(dòng)能級(jí)重疊，這種躍遷是“禁阻”躍遷。,磷光發(fā)射,激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過系間跨越到達(dá)激發(fā)三重態(tài)后，并迅速的以振動(dòng)弛豫到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài)(T1)的最低振動(dòng)能級(jí)上，第一激發(fā)三重態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子返回基態(tài)。此過程稱為磷光。磷光發(fā)射是不同多重態(tài)之間的躍遷(T1S0)屬于“禁阻”躍遷，因此磷光的壽命比熒光要長(zhǎng)的多，約為10-3s10s。所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還?？捎^察到發(fā)光現(xiàn)象，而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。,二、熒光壽命和熒光效率,熒光壽命和熒光效率是熒光物質(zhì)的重要發(fā)光參數(shù)熒光壽命熒光壽命是當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，常用f表示。當(dāng)熒光物質(zhì)受到一個(gè)極其短暫的光脈沖激發(fā)后，熒光強(qiáng)度的變化可用下列公式表示：,若t=f,此時(shí)Ft=（1/e）F0，則上式為：則K=1/f，將其帶入則得：以對(duì)t作圖，直線斜率即為：1/f,由此計(jì)算熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，可以進(jìn)行熒光混合物的分析。,熒光效率熒光效率也稱熒光量子效率，是發(fā)射熒光的分子數(shù)與總的激發(fā)態(tài)分子數(shù)之比。也可定義為物質(zhì)吸光后發(fā)射的熒光的光子數(shù)與吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比。熒光的去激發(fā)過程：發(fā)射熒光返回基態(tài)(強(qiáng)的熒光物）無輻射躍遷回到基態(tài)(低熒光物質(zhì)),熒光效率與熒光發(fā)射過程的速率及無輻射過程的速率有關(guān)。式中，Kf是熒光發(fā)射過程速率常數(shù)，Ki是系間跨越和外轉(zhuǎn)換等有關(guān)無輻射躍遷過程的速率常數(shù)總和。其中Kf主要取決于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而Ki主要取決于化學(xué)環(huán)境?；瘜W(xué)環(huán)境能使體系的Kf升高、Ki降低，從而可使體系的熒光增強(qiáng)；反之，則使體系的熒光減弱。,三、熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光分子都具有兩種特征的光譜，即激發(fā)光譜和熒光光譜。熒光激發(fā)光譜激發(fā)光譜是通過固定發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)而獲得的熒光強(qiáng)度(F)激發(fā)波長(zhǎng)(ex)的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜反映了在某一固定的發(fā)射波長(zhǎng)下，不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光的相對(duì)效率。激發(fā)光譜可以用于熒光物質(zhì)的鑒別，并作為進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)供選擇恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)。,熒光發(fā)射光譜通過固定激發(fā)波長(zhǎng)，掃描發(fā)射(即熒光測(cè)定)波長(zhǎng)所獲得的熒光強(qiáng)度(F)發(fā)射波長(zhǎng)(em)的關(guān)系的曲線為熒光發(fā)射曲線。熒光光譜反映了在相同的激發(fā)條件下，不同波長(zhǎng)處分子的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度。熒光光譜可用于熒光物質(zhì)的鑒別，并作為熒光測(cè)定時(shí)選擇恰當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng)或?yàn)V光片。,同步熒光光譜1971年Lloyd提出用同步掃描技術(shù)來繪制光譜圖。該技術(shù)是在同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的條件下，測(cè)繪光譜圖，所得到的熒光強(qiáng)度激發(fā)波長(zhǎng)(或發(fā)射波長(zhǎng))曲線為同步熒光光譜。熒光信號(hào)同步信號(hào),測(cè)定同步熒光光譜的三種方法：固定波長(zhǎng)同步掃描法：在掃描過程中，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)有一個(gè)固定的波長(zhǎng)差，即=emex=常數(shù)固定能量同步掃描法：使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差，即（1/ex1/em）107=常數(shù)?？勺儾ㄩL(zhǎng)同步掃描法：使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時(shí)進(jìn)行掃描，即波長(zhǎng)可變。,同步熒光光譜的特點(diǎn)：使光譜簡(jiǎn)化；使譜帶窄化；減小光譜的重疊現(xiàn)象；減小散色光的影響。這種光譜提高了分析測(cè)定的選擇性，避免了其它譜帶所引起的干擾。但對(duì)光譜學(xué)的研究不利，因?yàn)樗鼡p失了其它光譜所含的信息。,四、熒光光譜的特征,斯托克斯(Stokes)位移在溶液中，分子的熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是比其相應(yīng)的吸收(或激發(fā))光譜的波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒光發(fā)射這種波長(zhǎng)位移的現(xiàn)象稱為Stokes位移。原因：處于激發(fā)態(tài)的分子一方面由于振動(dòng)弛豫等損失了部分能量，另一方面溶劑分子的弛豫作用使其能量進(jìn)一步損失，因而產(chǎn)生了發(fā)射光譜波長(zhǎng)的位移。Stokes位移表明在熒光激發(fā)和發(fā)射之間所產(chǎn)生的能量損失。（見P220圖11-3）,鏡像對(duì)稱規(guī)則一般而言，分子的熒光發(fā)射光譜與其吸收光譜之間存在著鏡像關(guān)系。（見P220圖)鏡像對(duì)稱規(guī)則的產(chǎn)生是由于大多吸收光譜的形狀表明了分子的第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)，而熒光發(fā)射光譜則表明了分子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)。一般情況下，分子的基態(tài)和第一激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)類似，因此吸收光譜的形狀與熒光發(fā)射光譜的形狀呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。,熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)熒光分子，可以觀察到形狀相同的熒光發(fā)射光譜。這是由于熒光分子無論被激發(fā)到哪一個(gè)激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子經(jīng)振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程后最終回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。而分子的熒光發(fā)射總是從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)上。,五、影響熒光強(qiáng)度的因素,熒光是由具有熒光結(jié)構(gòu)的物質(zhì)吸收光后產(chǎn)生的，其發(fā)光強(qiáng)度與該物質(zhì)分子的吸光作用及熒光效率有關(guān)，影響物質(zhì)熒光強(qiáng)度的因素主要有兩個(gè)：分子結(jié)構(gòu)一般具有強(qiáng)熒光的分子都具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)、供電子取代基、剛性的平面結(jié)構(gòu)等。分子中至少具有一個(gè)芳環(huán)或具有多個(gè)共軛雙鍵的有機(jī)化合物才容易發(fā)射熒光，而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。發(fā)光分子所處的環(huán)境熒光分子所處的溶液環(huán)境對(duì)其熒光發(fā)射有直接的影響。因此適當(dāng)?shù)倪x取實(shí)驗(yàn)條件有利于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。,分子結(jié)構(gòu),躍遷類型：大多數(shù)熒光化合物多是由或n躍遷所致的激發(fā)態(tài)去活后，發(fā)生或n躍遷產(chǎn)生的。躍遷的量子效率高，是由于躍遷的摩爾吸光系數(shù)比n躍遷大1001000倍,躍遷的壽命(10-710-9s)又比n(10-510-7）躍遷壽命短，因此Kf較大；其次，系間跨越的速率常數(shù)小，有利于發(fā)射熒光。,共軛效應(yīng),含有躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)，最有用。含脂肪族和脂環(huán)族羰基結(jié)構(gòu)的化合物也會(huì)發(fā)射熒光，但這類化合物的數(shù)量比芳香族少。稠環(huán)化合物一般會(huì)產(chǎn)生熒光。最簡(jiǎn)單的雜環(huán)化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡咯）等不產(chǎn)生熒光。當(dāng)苯環(huán)被稠化至雜環(huán)核上時(shí)，吸收峰的摩爾吸光系數(shù)增加，因此喹啉、吲哚等會(huì)產(chǎn)生熒光。,取代基效應(yīng),苯環(huán)上的取代基會(huì)引起最大吸收波長(zhǎng)的位移及相應(yīng)熒光峰的改變。給電子基團(tuán)，使熒光增強(qiáng)。如:NH2,OH,OCH3,NHCH3和N(CH3)2等，吸電子基團(tuán)，使熒光減弱如:Cl,Br,I,NHCOCH3,NO2和COOH等，。,分子的剛性效應(yīng),在同樣長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性越強(qiáng)，熒光效率越大。本來不發(fā)生熒光或熒光較弱的物質(zhì)與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性共平面性增加，則可以產(chǎn)生熒光或增強(qiáng)熒光。如：8-羥基喹啉本身是弱熒光物質(zhì)，與Mg2+、Al3+形成配位化合物后，熒光增強(qiáng)。順反異構(gòu)體的熒光性,聯(lián)苯,芴,=0.2,=1.0,環(huán)境因素,熒光分子所處的溶液環(huán)境對(duì)其熒光發(fā)射有直接的影響。適當(dāng)?shù)倪x取實(shí)驗(yàn)條件有利于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。溶劑效應(yīng)溶劑的極性：溶劑的極性增大，躍遷的能量減小，紅移。溶劑的粘度溶劑的粘度降低，分子間碰撞機(jī)會(huì)增加，無輻射躍遷幾率增加，熒光減弱。,溫度的影響由于當(dāng)溫度降低時(shí)，溶劑的粘度增大，溶劑的弛豫作用大大減小，熒光發(fā)射幾率增加；當(dāng)溫度升高時(shí)，碰撞頻率增加，外轉(zhuǎn)換的去激發(fā)幾率增加，熒光發(fā)射幾率變小。一般地，隨溫度降低，溶液中熒光效率和熒光強(qiáng)度將增大，并伴隨光譜的藍(lán)移。因此，選擇低溫條件進(jìn)行熒光檢測(cè)將有利于提高分析的靈敏度。,pH的影響對(duì)于含有酸性或堿性基團(tuán)的熒光物質(zhì)而言，溶液的pH將對(duì)這類物質(zhì)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生較大的影響。如：在pH712的溶液中，苯胺以分子形式存在，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；當(dāng)pH3、pH13時(shí)，苯胺以陽離子、陰離子形式存在，均無熒光。溶液的pH也影響金屬配合物的熒光性質(zhì)。,熒光猝滅熒光猝滅：熒光分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子之間相互作用，使熒光強(qiáng)度減弱的作用。熒光猝滅劑：能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。動(dòng)態(tài)猝滅：被激發(fā)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生碰撞，使熒光分子以無輻射形式躍遷回到基態(tài)而使熒光猝滅。靜態(tài)猝滅：熒光分子與猝滅劑形成不發(fā)光的基態(tài)配合物從而使熒光猝滅。氧是最常見的碰撞猝滅劑，因此在較嚴(yán)格的熒光實(shí)驗(yàn)室中，需要除氧。利用熒光的這兩種猝滅作用可以檢測(cè)猝滅劑的濃度。,自猝滅：當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較大時(shí)，會(huì)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的熒光分子與基態(tài)的熒光分子碰撞從而使熒光猝滅。因此在熒光測(cè)量中，熒光物質(zhì)的濃度不應(yīng)太大。當(dāng)物質(zhì)中存在能與熒光分子發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的物質(zhì)時(shí)，有時(shí)也使體系的熒光強(qiáng)度下降。,內(nèi)濾作用內(nèi)濾作用：當(dāng)溶液中存在能吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)光或發(fā)射光的物質(zhì)時(shí)，會(huì)使體系熒光減弱的現(xiàn)象。散射光散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)可消除此干擾。例：見書224225頁,第二節(jié)熒光定量分析方法,一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系I0IF在ECl0.05時(shí)，F(xiàn)=KC,溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系；在ECl0.05，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度不呈線性關(guān)系；熒光分析法的測(cè)定靈敏度高。,二、定量分析法,校正曲線法比例法聯(lián)立方程式法,第三節(jié)熒光分光光度計(jì)第四節(jié)熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介,掌握內(nèi)容：分子熒