微生物限度檢測方法驗證操作規(guī)程(2015年版)

微生物限度檢查方法驗證操作規(guī)程一個目的確認所采用的方法適用于該產(chǎn)品的微生物限度檢測。2根據(jù)中國藥典 2015版。3個范圍所有需要微生物限度檢查的產(chǎn)品。4責任4.1驗證小組負責驗證方法驗證/確認方案的起草、驗證/確認方案的實施。4.2驗證委員會負責驗證/確認方案的審查、驗證/確認結(jié)論的審查。五個程序5.1驗證小組提出驗證申請，驗證方案制定完成后，填寫確認和驗證方案審批表，驗證小組簽署，報告驗證委員會審查，生產(chǎn)責任人和質(zhì)量責任人批準后，驗證方案制定人員可以訓(xùn)練驗證小組的剩馀人員，根據(jù)驗證方案進行考試。5.2試驗完成后，可立即制作驗證報告，填寫驗證報告審批表，經(jīng)驗驗證小組簽署，報告驗證委員會審查，生產(chǎn)負責人和質(zhì)量負責人批準后，實施驗證報告結(jié)論。6內(nèi)容6.1概要通過驗證，證實了所采用的方法適用于該產(chǎn)品的好氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定及菌的檢測。 根據(jù)樣品特性制定檢驗方法和檢驗條件，按制定的方案進行試驗，根據(jù)檢驗結(jié)果判斷是否符合檢驗標準。 如果符合，在驗證的方法和條件下進行產(chǎn)品的微生物限度檢查，不符合的情況下，重新制定檢查方法和檢查條件，驗證結(jié)果到達設(shè)定的驗證基準為止。6.2好氧細菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證6.2.1驗證用菌株銅綠假單胞菌CMCC(B)10 104金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003枯草芽孢桿菌CMCC(B)63 501曲霉CMCC(F)98 003念珠菌CMCC(F)98 0016.2.2驗證用菌液的制備將6.2.2.1銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種到胰大豆胨液體培養(yǎng)基中，在3035下培養(yǎng)1824小時。 每次采集1ml上述培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉胨緩沖液制成適當濃度的菌懸濁液，進行預(yù)備。6.2.2.2將念珠菌接種到薩爾維亞液培養(yǎng)基中，在2025下培養(yǎng)23天。 取上述培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉胨緩沖液制備適當濃度的菌懸浮液，進行預(yù)備。將6.2.2.3曲霉接種到糖精瓊脂培養(yǎng)基中，在2025下培養(yǎng)57天，加入含0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉蛋白緩沖液，洗脫孢子。 然后，用適當?shù)姆椒▽㈡咦討腋∫何霟o菌試管內(nèi)，用含有0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉胨緩沖液制作適當濃度的孢子懸浮液，進行預(yù)備。6.2.3供試液的制備6.2.3.1水溶性供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-胨緩沖液或干酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋，制成1:10供試液。 根據(jù)需要，將供試液的pH調(diào)整為68。 必要時，用同一稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。 也可以將混合了水溶性液體制劑的試驗品原液用作試驗液。6.2.3.2水不溶性非油脂類的供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-胨緩沖液或干酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋，制成1:10供試液。 分散力低的試驗品可以在稀釋液中加入表面活性劑，例如0.1的聚山梨80，使試驗品均勻分散。 根據(jù)需要，將供試液的pH調(diào)整為68。 必要時，用稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。6.2.3.3油脂類的供試品取樣品，加入無菌十四烷酸異丙酯使其溶解，或者與最少量即可乳化樣品的無菌山梨酯80和其他無菌表面活性劑充分混合。 表面活性劑的溫度一般在40(特殊情況下最大為45)以下，小心混合，根據(jù)需要在水浴中進行，加入預(yù)熱的稀釋液，以1:10供給試驗液，保溫、混合，在最短時間內(nèi)形成乳液。 根據(jù)需要用稀釋液或含有上述表面活性劑稀釋液進一步稀釋成10倍系列.6.2.3.4腸溶性制劑的供試品取供試品10g，加入pH6.8的無菌磷酸鹽緩沖液，放入45的水浴中振蕩、溶解，制成1:10的供試液。 必要時，用稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。6.2.4接種和稀釋如下進行供試液接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。 加入的菌液體積不得超過供試液體積的1%。 為了確認供試品中的微生物被充分檢測出來，首先選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法的適用性試驗。6.2.4.1試驗組采集上述制備的供試液，加入試驗菌液混合，使每1ml供試液或每1張過濾膜的供試液所含菌量在100cfu以下。6.2.4.2供試品對照組取制備的供試液，用稀釋液代替菌液與試驗組操作。6.2.4.3菌液對照組取代試驗液不含中和劑和滅活劑的相應(yīng)稀釋液，通過試驗組的操作加入試驗菌液進行微生物回收試驗。供試品的抗菌活性和溶解性差，不能選擇最低稀釋級的供試液進行方法適應(yīng)性試驗的，應(yīng)用適當?shù)姆椒ㄟM一步處理供試液。 供試品抑制微生物生長的作用無法通過其他方法消除時，供試液經(jīng)中和、稀釋或薄膜過濾處理后，可加入供試菌懸濁液進行方法的適用性試驗。6.2.5除去或滅活抗菌活性供試液接種后，按照以下微生物回收中規(guī)定的方法進行微生物計數(shù). 試驗組菌落數(shù)減去試驗品對照組菌落數(shù)的值不足菌液對照組菌落數(shù)的50%時，可通過下述方法去除試驗品的抗菌活性。6.2.5.1增加稀釋液或培養(yǎng)基的體積。6.2.5.2加入適當?shù)闹泻蛣┗驕缁顒?。中和劑和滅活?表1 )可用于去除干擾物的抗菌活性，但希望在稀釋液和培養(yǎng)基滅菌前添加。 使用中和劑或滅活劑時，試驗中應(yīng)設(shè)置中和劑或滅活劑對照組。 即用稀釋液代替供試劑與試驗組操作，確認其有效性和微生物無毒性。 中和劑或滅活劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)之比應(yīng)在0.52的范圍內(nèi)。表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選擇中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍系化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸波利山梨汞巰基乙酸鹽汞、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA，喹諾酮類抗生素鎂離子或鈣離子磺胺類藥物對氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺類抗生素內(nèi)酰胺酶6.2.5.3采用薄膜過濾法。6.2.5.4上述幾種方法的并用。沒有適當消除試驗品抗菌活性的方法，特定試驗菌回收失敗，表明試驗品對該試驗菌具有較強的抗菌活性，同時也表明試驗品不易被這種微生物污染。 但供試品只對特定試驗菌株有抑制作用，對其他菌株無抑制作用。 因此，應(yīng)根據(jù)供試產(chǎn)品必須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)律，在不影響檢測結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)用使微生物生長的更高稀釋水平的供試液進行計數(shù)方法的適用性試驗。 方法適用性試驗滿足要求時，以該稀釋級供試液為最低稀釋級供試液進行供試驗品檢驗。6.2.6供試品中微生物的回收計數(shù)方法適用性試驗用的各試驗菌應(yīng)逐一進行微生物回收試驗。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法、MPN法。6.2.6.1平皿法平皿法包括澆注法和涂布法。 每株試驗菌按培養(yǎng)基至少配制2個平皿，根據(jù)算術(shù)平均值計數(shù)結(jié)果。6.2.6.1.1倒入法取上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“除去或滅活抗菌活性”中制備的供試液1ml，可放置直徑90mm的無菌平盤，注入溫度不超過45的熔融的胰酪蛋白大豆蛋白瓊脂或糖精瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混合使用直徑大的平皿時，培養(yǎng)基的用量必須相應(yīng)培養(yǎng)。 在表1所規(guī)定條件下進行培養(yǎng)計數(shù)。 該法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。 計算各試驗組的平均菌落數(shù)。6.2.6.1.2涂布法采取溶解于溫度不超過45的胰酪蛋白瓊脂或糖精瓊脂培養(yǎng)基1520ml，注入直徑90mm的無菌平盤中，凝固成平板，用適當?shù)姆椒ㄊ古囵B(yǎng)基表面干燥。 使用直徑大的平皿，培養(yǎng)基的用量也要相應(yīng)地增加。 在各平板表面接種0.1ml以上通過上述供試液的調(diào)制、接種和稀釋和抗菌活性的除去或滅活調(diào)制的供試液. 在表1所規(guī)定條件下進行培養(yǎng)計數(shù)。 該法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。 計算各試驗組的平均菌落數(shù)。6.2.6.2薄膜過濾法中采用的過濾膜孔徑為0.45m以下，直徑一般為50mm，采用其它直徑的過濾膜時，洗滌量應(yīng)相應(yīng)調(diào)整。 供試品及其溶劑不影響過濾器材質(zhì)被微生物俘獲。 過濾器和過濾器使用前必須用適當?shù)姆椒缇?使用時請保證過濾器在過濾前后的完整性。 過濾水溶性供試液前先過濾少量沖洗液，潤濕過濾器。 油類是供試品，過濾器和過濾器在使用前必須充分干燥。 為了發(fā)揮過濾膜的最大過濾效率，必須注意試驗品溶液和清洗液復(fù)蓋過濾膜整個表面。 供試液用膜過濾后，需用沖洗液沖洗過濾膜時，一片過濾膜的沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過1000ml。 確保薄膜上的微生物不受損傷。將以上述“供試液的調(diào)制”、“接種和稀釋”和“抗菌活性的除去或滅活”調(diào)制的供試液的適量(一般相當于1g、1ml或10 cm2的供試品，供試品中含有的菌數(shù)多的情況下，供試液可以適當減量)加入適量的稀釋液中混合，進行過濾。 用適量的沖洗液沖洗過濾器。好氧菌總數(shù)測定過濾菌面粘貼在胰大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上的霉菌和酵母總數(shù)，移動過濾菌面粘貼在薩爾維亞瓊脂培養(yǎng)基平板上。 在表1所規(guī)定條件下進行培養(yǎng)計數(shù)。 每株試驗菌培養(yǎng)基至少制備一片過濾器。 該法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。6.2.6.3 MPN法MPN法的精度和精度不及薄膜過濾法和皿法，僅在供試品的好氧菌總數(shù)沒有適當?shù)挠嫈?shù)方法時使用，本法不適用于霉菌的計數(shù)。 使用MPN法時，按照以下順序進行。取上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“除去或滅活抗菌活性”制備的供試液的至少3個連續(xù)稀釋水平，每個稀釋水平取1ml根，分別接種到加有910ml胰酪蛋白大豆蛋白的培養(yǎng)基中，用同樣的方法測定菌液對照組的菌數(shù)。 必要時，可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑和滅活劑。接種管在3035培養(yǎng)3天，每天觀察各管微生物的生長狀況。 因供試品的原因難以判斷結(jié)果時，將該管培養(yǎng)物移植到胰大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基或胰大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察微生物有無生長。 根據(jù)微生物生長的管子的數(shù)量，從表2調(diào)查每1g或1ml供試品的好氧菌總數(shù)的可能數(shù)量。表2可微生物數(shù)量檢索表生長管數(shù)好氧菌總數(shù)的最大可能數(shù)信賴限度每根管包含樣品的g或ml數(shù)量MPN/g或ml下限值上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100 )。注意：如果表中所述的檢測量被改變?yōu)?g (或ml )并且被改變?yōu)?.1g (或ml )和0.01g (或ml )，則表中的數(shù)字應(yīng)當相應(yīng)地減少10倍以上，而不是0.01g (或ml )、0.001 g (或ml )和0.0001 g (或ml )6.2.7判定結(jié)果計數(shù)方法適用性的試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數(shù)減去試驗品組菌落數(shù)后的值與菌液組菌落數(shù)之比在0.52范圍內(nèi)的MPN法時，試驗組菌落數(shù)必須在菌液對照組菌落數(shù)的95%以內(nèi)如果各試驗菌回收試驗符合要求，按照所用供試液的制備方法和計數(shù)方法，計算該供試品的好氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。方法適用性確認時，如上述方法不要求回收一株或多株試驗菌，選擇最接近要求的方法和試驗條件進行試驗品檢驗。6.3控制細菌檢驗方法的驗證6.3.1驗證用菌株大腸桿菌CMCC