微生物限度檢測(cè)方法驗(yàn)證操作規(guī)程(2015年版)

微生物限度檢查方法驗(yàn)證操作規(guī)程一個(gè)目的確認(rèn)所采用的方法適用于該產(chǎn)品的微生物限度檢測(cè)。2根據(jù)中國(guó)藥典 2015版。3個(gè)范圍所有需要微生物限度檢查的產(chǎn)品。4責(zé)任4.1驗(yàn)證小組負(fù)責(zé)驗(yàn)證方法驗(yàn)證/確認(rèn)方案的起草、驗(yàn)證/確認(rèn)方案的實(shí)施。4.2驗(yàn)證委員會(huì)負(fù)責(zé)驗(yàn)證/確認(rèn)方案的審查、驗(yàn)證/確認(rèn)結(jié)論的審查。五個(gè)程序5.1驗(yàn)證小組提出驗(yàn)證申請(qǐng)，驗(yàn)證方案制定完成后，填寫(xiě)確認(rèn)和驗(yàn)證方案審批表，驗(yàn)證小組簽署，報(bào)告驗(yàn)證委員會(huì)審查，生產(chǎn)責(zé)任人和質(zhì)量責(zé)任人批準(zhǔn)后，驗(yàn)證方案制定人員可以訓(xùn)練驗(yàn)證小組的剩馀人員，根據(jù)驗(yàn)證方案進(jìn)行考試。5.2試驗(yàn)完成后，可立即制作驗(yàn)證報(bào)告，填寫(xiě)驗(yàn)證報(bào)告審批表，經(jīng)驗(yàn)驗(yàn)證小組簽署，報(bào)告驗(yàn)證委員會(huì)審查，生產(chǎn)負(fù)責(zé)人和質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后，實(shí)施驗(yàn)證報(bào)告結(jié)論。6內(nèi)容6.1概要通過(guò)驗(yàn)證，證實(shí)了所采用的方法適用于該產(chǎn)品的好氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定及菌的檢測(cè)。 根據(jù)樣品特性制定檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方案進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果判斷是否符合檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。 如果符合，在驗(yàn)證的方法和條件下進(jìn)行產(chǎn)品的微生物限度檢查，不符合的情況下，重新制定檢查方法和檢查條件，驗(yàn)證結(jié)果到達(dá)設(shè)定的驗(yàn)證基準(zhǔn)為止。6.2好氧細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證6.2.1驗(yàn)證用菌株銅綠假單胞菌CMCC(B)10 104金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003枯草芽孢桿菌CMCC(B)63 501曲霉CMCC(F)98 003念珠菌CMCC(F)98 0016.2.2驗(yàn)證用菌液的制備將6.2.2.1銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種到胰大豆胨液體培養(yǎng)基中，在3035下培養(yǎng)1824小時(shí)。 每次采集1ml上述培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉胨緩沖液制成適當(dāng)濃度的菌懸濁液，進(jìn)行預(yù)備。6.2.2.2將念珠菌接種到薩爾維亞液培養(yǎng)基中，在2025下培養(yǎng)23天。 取上述培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉胨緩沖液制備適當(dāng)濃度的菌懸浮液，進(jìn)行預(yù)備。將6.2.2.3曲霉接種到糖精瓊脂培養(yǎng)基中，在2025下培養(yǎng)57天，加入含0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白緩沖液，洗脫孢子。 然后，用適當(dāng)?shù)姆椒▽㈡咦討腋∫何霟o(wú)菌試管內(nèi)，用含有0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉胨緩沖液制作適當(dāng)濃度的孢子懸浮液，進(jìn)行預(yù)備。6.2.3供試液的制備6.2.3.1水溶性供試品取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-胨緩沖液或干酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋，制成1:10供試液。 根據(jù)需要，將供試液的pH調(diào)整為68。 必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。 也可以將混合了水溶性液體制劑的試驗(yàn)品原液用作試驗(yàn)液。6.2.3.2水不溶性非油脂類的供試品取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-胨緩沖液或干酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋，制成1:10供試液。 分散力低的試驗(yàn)品可以在稀釋液中加入表面活性劑，例如0.1的聚山梨80，使試驗(yàn)品均勻分散。 根據(jù)需要，將供試液的pH調(diào)整為68。 必要時(shí)，用稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。6.2.3.3油脂類的供試品取樣品，加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯使其溶解，或者與最少量即可乳化樣品的無(wú)菌山梨酯80和其他無(wú)菌表面活性劑充分混合。 表面活性劑的溫度一般在40(特殊情況下最大為45)以下，小心混合，根據(jù)需要在水浴中進(jìn)行，加入預(yù)熱的稀釋液，以1:10供給試驗(yàn)液，保溫、混合，在最短時(shí)間內(nèi)形成乳液。 根據(jù)需要用稀釋液或含有上述表面活性劑稀釋液進(jìn)一步稀釋成10倍系列.6.2.3.4腸溶性制劑的供試品取供試品10g，加入pH6.8的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，放入45的水浴中振蕩、溶解，制成1:10的供試液。 必要時(shí)，用稀釋液將供試液再稀釋10倍系列。6.2.4接種和稀釋如下進(jìn)行供試液接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。 加入的菌液體積不得超過(guò)供試液體積的1%。 為了確認(rèn)供試品中的微生物被充分檢測(cè)出來(lái)，首先選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)。6.2.4.1試驗(yàn)組采集上述制備的供試液，加入試驗(yàn)菌液混合，使每1ml供試液或每1張過(guò)濾膜的供試液所含菌量在100cfu以下。6.2.4.2供試品對(duì)照組取制備的供試液，用稀釋液代替菌液與試驗(yàn)組操作。6.2.4.3菌液對(duì)照組取代試驗(yàn)液不含中和劑和滅活劑的相應(yīng)稀釋液，通過(guò)試驗(yàn)組的操作加入試驗(yàn)菌液進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。供試品的抗菌活性和溶解性差，不能選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)的，應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)一步處理供試液。 供試品抑制微生物生長(zhǎng)的作用無(wú)法通過(guò)其他方法消除時(shí)，供試液經(jīng)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后，可加入供試菌懸濁液進(jìn)行方法的適用性試驗(yàn)。6.2.5除去或滅活抗菌活性供試液接種后，按照以下微生物回收中規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù). 試驗(yàn)組菌落數(shù)減去試驗(yàn)品對(duì)照組菌落數(shù)的值不足菌液對(duì)照組菌落數(shù)的50%時(shí)，可通過(guò)下述方法去除試驗(yàn)品的抗菌活性。6.2.5.1增加稀釋液或培養(yǎng)基的體積。6.2.5.2加入適當(dāng)?shù)闹泻蛣┗驕缁顒?。中和劑和滅活?表1 )可用于去除干擾物的抗菌活性，但希望在稀釋液和培養(yǎng)基滅菌前添加。 使用中和劑或滅活劑時(shí)，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置中和劑或滅活劑對(duì)照組。 即用稀釋液代替供試劑與試驗(yàn)組操作，確認(rèn)其有效性和微生物無(wú)毒性。 中和劑或滅活劑對(duì)照組菌落數(shù)與菌液對(duì)照組菌落數(shù)之比應(yīng)在0.52的范圍內(nèi)。表1常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選擇中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍系化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸波利山梨汞巰基乙酸鹽汞、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA，喹諾酮類抗生素鎂離子或鈣離子磺胺類藥物對(duì)氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺類抗生素內(nèi)酰胺酶6.2.5.3采用薄膜過(guò)濾法。6.2.5.4上述幾種方法的并用。沒(méi)有適當(dāng)消除試驗(yàn)品抗菌活性的方法，特定試驗(yàn)菌回收失敗，表明試驗(yàn)品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)也表明試驗(yàn)品不易被這種微生物污染。 但供試品只對(duì)特定試驗(yàn)菌株有抑制作用，對(duì)其他菌株無(wú)抑制作用。 因此，應(yīng)根據(jù)供試產(chǎn)品必須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)律，在不影響檢測(cè)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)用使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋水平的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)。 方法適用性試驗(yàn)滿足要求時(shí)，以該稀釋級(jí)供試液為最低稀釋級(jí)供試液進(jìn)行供試驗(yàn)品檢驗(yàn)。6.2.6供試品中微生物的回收計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法、MPN法。6.2.6.1平皿法平皿法包括澆注法和涂布法。 每株試驗(yàn)菌按培養(yǎng)基至少配制2個(gè)平皿，根據(jù)算術(shù)平均值計(jì)數(shù)結(jié)果。6.2.6.1.1倒入法取上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“除去或滅活抗菌活性”中制備的供試液1ml，可放置直徑90mm的無(wú)菌平盤(pán)，注入溫度不超過(guò)45的熔融的胰酪蛋白大豆蛋白瓊脂或糖精瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混合使用直徑大的平皿時(shí)，培養(yǎng)基的用量必須相應(yīng)培養(yǎng)。 在表1所規(guī)定條件下進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 該法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。 計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。6.2.6.1.2涂布法采取溶解于溫度不超過(guò)45的胰酪蛋白瓊脂或糖精瓊脂培養(yǎng)基1520ml，注入直徑90mm的無(wú)菌平盤(pán)中，凝固成平板，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ古囵B(yǎng)基表面干燥。 使用直徑大的平皿，培養(yǎng)基的用量也要相應(yīng)地增加。 在各平板表面接種0.1ml以上通過(guò)上述供試液的調(diào)制、接種和稀釋和抗菌活性的除去或滅活調(diào)制的供試液. 在表1所規(guī)定條件下進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 該法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。 計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。6.2.6.2薄膜過(guò)濾法中采用的過(guò)濾膜孔徑為0.45m以下，直徑一般為50mm，采用其它直徑的過(guò)濾膜時(shí)，洗滌量應(yīng)相應(yīng)調(diào)整。 供試品及其溶劑不影響過(guò)濾器材質(zhì)被微生物俘獲。 過(guò)濾器和過(guò)濾器使用前必須用適當(dāng)?shù)姆椒缇?使用時(shí)請(qǐng)保證過(guò)濾器在過(guò)濾前后的完整性。 過(guò)濾水溶性供試液前先過(guò)濾少量沖洗液，潤(rùn)濕過(guò)濾器。 油類是供試品，過(guò)濾器和過(guò)濾器在使用前必須充分干燥。 為了發(fā)揮過(guò)濾膜的最大過(guò)濾效率，必須注意試驗(yàn)品溶液和清洗液復(fù)蓋過(guò)濾膜整個(gè)表面。 供試液用膜過(guò)濾后，需用沖洗液沖洗過(guò)濾膜時(shí)，一片過(guò)濾膜的沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000ml。 確保薄膜上的微生物不受損傷。將以上述“供試液的調(diào)制”、“接種和稀釋”和“抗菌活性的除去或滅活”調(diào)制的供試液的適量(一般相當(dāng)于1g、1ml或10 cm2的供試品，供試品中含有的菌數(shù)多的情況下，供試液可以適當(dāng)減量)加入適量的稀釋液中混合，進(jìn)行過(guò)濾。 用適量的沖洗液沖洗過(guò)濾器。好氧菌總數(shù)測(cè)定過(guò)濾菌面粘貼在胰大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上的霉菌和酵母總數(shù)，移動(dòng)過(guò)濾菌面粘貼在薩爾維亞瓊脂培養(yǎng)基平板上。 在表1所規(guī)定條件下進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 每株試驗(yàn)菌培養(yǎng)基至少制備一片過(guò)濾器。 該法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。6.2.6.3 MPN法MPN法的精度和精度不及薄膜過(guò)濾法和皿法，僅在供試品的好氧菌總數(shù)沒(méi)有適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)方法時(shí)使用，本法不適用于霉菌的計(jì)數(shù)。 使用MPN法時(shí)，按照以下順序進(jìn)行。取上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“除去或滅活抗菌活性”制備的供試液的至少3個(gè)連續(xù)稀釋水平，每個(gè)稀釋水平取1ml根，分別接種到加有910ml胰酪蛋白大豆蛋白的培養(yǎng)基中，用同樣的方法測(cè)定菌液對(duì)照組的菌數(shù)。 必要時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑和滅活劑。接種管在3035培養(yǎng)3天，每天觀察各管微生物的生長(zhǎng)狀況。 因供試品的原因難以判斷結(jié)果時(shí)，將該管培養(yǎng)物移植到胰大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基或胰大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察微生物有無(wú)生長(zhǎng)。 根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管子的數(shù)量，從表2調(diào)查每1g或1ml供試品的好氧菌總數(shù)的可能數(shù)量。表2可微生物數(shù)量檢索表生長(zhǎng)管數(shù)好氧菌總數(shù)的最大可能數(shù)信賴限度每根管包含樣品的g或ml數(shù)量MPN/g或ml下限值上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100 )。注意：如果表中所述的檢測(cè)量被改變?yōu)?g (或ml )并且被改變?yōu)?.1g (或ml )和0.01g (或ml )，則表中的數(shù)字應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地減少10倍以上，而不是0.01g (或ml )、0.001 g (或ml )和0.0001 g (或ml )6.2.7判定結(jié)果計(jì)數(shù)方法適用性的試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去試驗(yàn)品組菌落數(shù)后的值與菌液組菌落數(shù)之比在0.52范圍內(nèi)的MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)必須在菌液對(duì)照組菌落數(shù)的95%以內(nèi)如果各試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)符合要求，按照所用供試液的制備方法和計(jì)數(shù)方法，計(jì)算該供試品的好氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，如上述方法不要求回收一株或多株試驗(yàn)菌，選擇最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)品檢驗(yàn)。6.3控制細(xì)菌檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證6.3.1驗(yàn)證用菌株大腸桿菌CMCC