實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)VIP

實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚?） 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；（2） 掌握使用水平式電泳儀的方法；（3） 學(xué)習(xí)在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行RNA電泳的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定： （1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。 （2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。 （3）電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 （4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成復(fù)合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如Sybergreen。 常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經(jīng)甲醛進(jìn)行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因?yàn)樽冃院蟮腞NA是單鏈，其泳動(dòng)速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進(jìn)行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標(biāo)記的探針發(fā)生高效雜交?！驹噭┡c器材】（一）材料電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等（二）試劑1、 50TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸， 18.6g EDTA。2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。3、 DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。4、 RNA甲醛變性膠上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高壓滅菌備用。5、 5甲醛變性膠電泳緩沖液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸鈉，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，過濾除菌，室溫避光保存。淡黃色緩沖液可正常使用，深黃色應(yīng)棄用。【操作方法】（一）常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表： 瓊脂糖的含量（%） 分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb） 0.3 60-5 0.620-10.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.54-0.22.0 3-0.11制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液；加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。2膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50左右時(shí)，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；3加樣：點(diǎn)樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點(diǎn)樣量）。4電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。5觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。 （二） 在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行的RNA電泳（選做） 配制23 mL甲醛電泳膠：0.336g瓊脂糖溶于20mL DEPC水中，冷卻至60C，加入5mL的5x甲醛變性膠電泳緩沖液和5.5mL的甲醛，在通風(fēng)櫥內(nèi)倒膠，冷卻30分鐘后使用。 甲醛變性膠RNA樣品的制備：1L RNA，5甲醛變性膠電泳緩沖液0.5L，甲醛0.7L，甲酰胺2L，65oC加熱15min，迅速冰浴，加1L上樣緩沖液和0.2L的EB。 步驟： 1 用3%過氧化氫浸泡電泳槽、膠板、梳子30分鐘以上。 2 膠板的制備：按常規(guī)瓊脂糖電泳法。 3 預(yù)電泳：1甲醛變性膠電泳緩沖液，預(yù)電泳10 min。電壓為5V/cm。 4 小心地進(jìn)行點(diǎn)樣，記錄樣品次序與點(diǎn)樣量；然后開始電泳，電壓為3-4V/cm。 5 觀察和拍照：在波長為254nm的紫外燈下觀察電泳膠板并拍照保存圖片?！咀⒁馐马?xiàng)與提示】（1）EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進(jìn)行稀釋（達(dá)到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。（2）由于EB會(huì)嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準(zhǔn)確地測定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色的方法。（3）總RNA的分析：哺乳動(dòng)物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA組成，28S和18S rRNA處為明顯的亮帶（相當(dāng)于4.5kb和1.9kb），28S/18S應(yīng)為1.5-2.5/1；植物、昆蟲、酵母和兩棲動(dòng)物的RNA帶分布較小，約為0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出現(xiàn)拖帶，說明RNA已經(jīng)有部分降解，如果28S和18S rRNA