五植物離體快速繁殖PPT課件

.,1,第五章植物離體微繁,主要內(nèi)容：1.植物離體微繁2.影響植物離體微繁成功的因素3.植物離體微繁過程中常見異?，F(xiàn)象及對策,.,2,植物有哪些繁殖方法？,思考:,.,3,分株繁殖,壓條繁殖,播種繁殖,嫁接繁殖,.,4,扦插繁殖,組織培養(yǎng)繁殖,.,5,1.植物離體微繁,植物離體微繁(micropropagation)：是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行的一種營養(yǎng)繁殖方法，是常規(guī)營養(yǎng)繁殖方法的一種擴展和延伸。是在短期內(nèi)獲得大量遺傳性狀一致的個體的方法。屬離體無性繁殖(propagationinvitro)。又稱為快速繁殖（rapidcloneprogagation）。,.,6,植物離體微繁的特點,1.繁殖系數(shù)高，繁殖周期短，繁殖速度快：它的高速度是以下三種因素構(gòu)成的：有較高的增殖倍數(shù);較短的增殖周期；周年生產(chǎn)。2.應用廣泛，是推廣良種的重要手段：占用空間小，生產(chǎn)效率高，省時、省工、節(jié)約土地。3.繁殖材料用量少，不受季節(jié)限制，可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)；4.能獲得無毒苗木無性系5.木本植物應用潛力大：繁殖各種珍稀、瀕危、名貴、突變物種。,.,7,1.1植物離體微繁過程,第一階段穩(wěn)定無菌培養(yǎng)體系的建立時期第二階段穩(wěn)定培養(yǎng)系的增殖、生長和增狀時期第三階段誘導莖芽生根形成小苗時期第四階段生根小苗移栽和馴化時期第五階段商品苗培育時期,.,8,第一階段：穩(wěn)定無菌培養(yǎng)體系的建立時期,任何植物細胞或組織培養(yǎng)體系的建立，都必須采制適宜的外植體。外植體的選擇有什么要求呢？第一，選擇優(yōu)良的種質(zhì)：易于離體培養(yǎng)的種類、品種、類型；生產(chǎn)或研究上意義比較大的種類、品種、類型。第二，選擇健壯的植株：第三，選擇合適的部位莖尖：生長速度快，遺傳穩(wěn)定，無病毒分布。但材料來源有限，為此莖段也是重要來源。葉片：采用幼嫩的葉片較好。如：秋海棠、矮牽牛、菊花等?；ǎɑɡ伲簱?jù)一些學者的觀點，在花誘導之前細胞的脫分化容易發(fā)生，故外植體常取發(fā)育早期階段的花，即花蕾。胚：大多數(shù)花卉都可用胚培養(yǎng)的方式進行快繁，如：百合、羽葉甘藍、蝴蝶蘭、卡特蘭等。,.,9,外植體的選擇,第四，取材季節(jié)合理：選取外植體的季節(jié)和時間，對培養(yǎng)材料的啟動和培養(yǎng)至關(guān)重要。一般在生長季春夏。第五，考慮器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡；第六，選擇大小合適的外植體；外植體過大，不易滅菌，過小，不易成活。一般0.5-1cm；脫毒培養(yǎng)0.2-0.5cm。,.,10,外植體的滅菌,無菌的外植體材料是植物組織培養(yǎng)成功的重要前提與可靠保證，而消毒則是獲得無菌外植體的有效方法。取來的外植體需要經(jīng)過仔細的表面滅菌處理，外植體滅菌常用消毒劑。消毒注意事項：1.正確選擇消毒劑種類及濃度、消毒時間，減少組織的死亡.2.在用消毒劑對材料表面消毒后，必須用無菌水漂洗3次以上以除去殘留殺菌劑，但用酒精消毒時，則不必漂洗。3.與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移至無菌基質(zhì)前需切除，因為消毒劑會阻礙植物細胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。4.在外植體污染嚴重時，應用流水漂洗1h以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。5.Hgcl2效果最好，但較難從外植體去除，對人的傷害也最大，用后要用水沖洗至少5次。,.,11,外植體的接種和培養(yǎng),外植體的接種無菌操作外植體表面滅菌切取分離無菌培養(yǎng)基外植體的培養(yǎng)光照、溫度、濕度、培養(yǎng)基pH、氣體調(diào)節(jié),.,12,接種材料修整與沖洗,.,13,材料表面滅菌,.,14,1.葉片0.5cm0.5cm,2.微莖尖0.2-0.5mm,3.帶節(jié)莖段0.5-1.0cm,外植體切割,4.芽叢分離,.,15,頂梢切割成0.51.0cm的莖尖；（除葉,剝?nèi)バ菝哐康镊[片)；莖尖流水沖洗24h；75%酒精迅速漂洗30s；0.1%升汞或稀釋20倍的次氯酸鈉液消毒58min(取自老枝條上的可適當延長時間)；無菌水沖洗3-5次。,材料處理及消毒,.,16,外植體接入培養(yǎng)基,.,17,注意,無菌培養(yǎng)體系的建立需注意下面兩個問題：1.采樣和表面滅菌；2.首次接種污染率的估算與對策：首次接種，小容器，多數(shù)量，盡量分散，互相隔離，效果最好。,.,18,從植物組織培養(yǎng)積累的知識中，可將植物再生過程劃分為四種方式：1)頂芽和腋芽的發(fā)育2)不定芽的發(fā)育3)體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育4)原球莖的發(fā)育,第二階段：穩(wěn)定培養(yǎng)系的增殖、生長和增狀時期（誘導外植體生長與分化）,.,19,1)頂芽和腋芽的發(fā)育,頂芽和腋芽在離體培養(yǎng)中都可被誘導而發(fā)育。從芽萌發(fā)出苗，即枝條，枝條向上延伸，新形成的芽將逐漸發(fā)育。如果將新形成的芽切割下來，使之再萌發(fā)出新的枝條，在適當?shù)臈l件下使枝條生根，并種植到土壤中去，便完成了植物再生的全過程。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時只能采用頂芽，側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其它如種子，萌發(fā)后取枝條等也可以。,.,20,幼嫩莖尖,營養(yǎng)芽,.,21,莖尖培養(yǎng),在頂芽的培養(yǎng)中，還有較為特殊的一種方式，即采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織為材料，由它作為外植體。過去常被稱為“分生組織培養(yǎng)”，但目前多數(shù)學者認為以稱作“莖尖培養(yǎng)”為宜。真正的莖尖分生組織是被限制在一極小的范圍內(nèi)，那里的細胞幾乎沒有分化，在活躍地進行細胞分裂，保持著強烈的再生分化能力，這個部分不包括葉原基，處于莖的極頂尖處。,.,22,根據(jù)培養(yǎng)目的和取材大小分為：微莖尖培養(yǎng)普通莖尖培養(yǎng),莖尖培養(yǎng)類型,.,23,普通莖尖指幾毫米到幾十毫米的芽尖及側(cè)芽,.,24,微莖尖為0.3-0.5mm,.,25,普通莖尖培養(yǎng)方法,取材,材料處理及消毒,培養(yǎng),接種,馴化移栽,.,26,直接取材：在生長旺盛、枝條健壯、無病的母株上選生長不久、雜菌污染少的頂梢（12cm）（取前可噴殺菌藥），取頂芽或側(cè)芽。從試管苗獲取。,取材,取1-2頂梢,.,27,莖尖培養(yǎng)時需要注意的問題,一般都采用稍大一些的莖尖來培養(yǎng)。之所以用莖尖培養(yǎng)，是為了脫除病毒病的危害，因為只有莖尖未受病毒侵染。如果是經(jīng)過病毒鑒定的母株，或該種植物有無病毒并不在考慮之中，當然最好是采用腋芽，或帶腋芽的莖切段。過小的莖尖只有很低的存活率，并且最初生長太慢。如果某些植物具有比較強的頂端優(yōu)勢，那么在培養(yǎng)中也同樣有所表現(xiàn)，往往頂芽抑制側(cè)芽的萌發(fā)，這樣總是獲得分枝很少的獨立的枝條，限制了繁殖的速度，通常采取切除頂芽和適當增加細胞分裂素兩項措施加以克服。,.,28,莖段培養(yǎng)過程,將經(jīng)過表面消毒的莖段在無菌條件下，切成幾厘米長帶芽的節(jié)段，接種在固體培養(yǎng)基上。經(jīng)過培養(yǎng)后，莖段可直接發(fā)生不定芽，或先誘導形成愈傷組織，再脫分化形成再生苗。把再生苗進行切割，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，便可得到完整的小植株。,.,29,圖示莖段培養(yǎng)過程,去葉片用自來水沖洗,.,30,2)不定芽的發(fā)育,在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽分化，通常經(jīng)歷兩個不同的生長時期：首先外植體要經(jīng)脫分化過程，形成或不形成愈傷組織；第二步由已脫分化的細胞或新形成的愈傷組織細胞，再分化形成一些分生細胞團。然后由這些分生組織形成器官原基，在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性。,.,31,3)體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育,體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細胞發(fā)生的。通過體細胞胚狀體的發(fā)生，來進行無性系的大量繁殖具有極大的潛力。其特點是：成苗數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整。,.,32,體細胞胚狀體的發(fā)生方式,胚狀體產(chǎn)生的五種方式：由外植體的表皮細胞直接產(chǎn)生胚狀體；由外植體組織內(nèi)部的細胞產(chǎn)生胚狀體；由愈傷組織的表面細胞產(chǎn)生胚狀體；由胚性細胞復合體的表面細胞產(chǎn)生胚狀體；由單個游離細胞直接產(chǎn)生胚狀體。,.,33,4）原球莖的發(fā)育,大部分蘭花的培養(yǎng)屬于這一類型。原球莖特點:縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。原球莖是一種類胚組織，培養(yǎng)蘭花的莖尖或腋芽可直接產(chǎn)生原球莖，繼而分化成植株，也可繼代增殖為原球莖。特點：受材料的局限性較大。,.,34,初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。,小結(jié),.,35,在初代培養(yǎng)的基礎上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，也難以直接種植到栽培介質(zhì)中去，這些培養(yǎng)的材料可統(tǒng)稱為中間繁殖體，它們需要進一步培養(yǎng)增殖，使之越來越多，才能發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進行過程。但在達到相當?shù)臄?shù)量之后，則應考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。,第三階段：誘導莖芽生根形成小苗時期,.,36,繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當數(shù)量的無根苗，最后能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎，那么經(jīng)10代將生成210株苗。增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。,繼代培養(yǎng),.,37,繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。,繼代培養(yǎng)中擴繁的方法,.,38,在中間繁殖體增殖到一定數(shù)量后，就使部分培養(yǎng)物分流，進入壯苗與生根途徑。試管內(nèi)生根或壯苗階段的意義：試管內(nèi)生根或壯苗的階段，目的是為了成功地移植到試管外的環(huán)境中，也是使試管苗適應外部環(huán)境的一個過渡時期。在生根壯苗培養(yǎng)基上，大多數(shù)植物要分離成單苗，有的可分成小叢苗，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后應停止增殖，迅速生根，同時苗也長高了，以后便于移栽。,.,39,莖芽生根誘導的途徑：1、是試管（瓶）內(nèi)生根2、是試管（瓶）外生根,.,40,5.2.3.1試管內(nèi)生根將長到一定長度的微枝轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。（IBANAA）植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的跟為不定根，依據(jù)根形成的部位又分為皮部根和愈傷根。,.,41,思考:皮部根和愈傷根哪個利于組織培養(yǎng)？為什么,.,42,判斷試管苗生根好壞依據(jù)：1、根系質(zhì)量（粗度、長度）2、根系數(shù)量（條數(shù)，毛細根）,.,43,5.2.3.2試管外生根試管外生根技術(shù)是將組織培養(yǎng)莖芽的生根誘導同馴化培養(yǎng)結(jié)合在一起，直接將莖芽扦插到試管外有菌環(huán)境中，邊誘導生根邊馴化培養(yǎng)。,優(yōu)勢：1、試管外生根苗比試管內(nèi)生根苗生理活性更好；2、經(jīng)濟成本相對試管內(nèi)生根要低很多,.,44,第四階段：生根小苗移栽和馴化時期,.,45,試管苗的特點及移栽,從以下三個方面講述:1.試管苗的生長環(huán)境；2.試管苗的弱點；3.克服弱點，提高移栽成活率的措施。,.,46,試管苗的生長環(huán)境,無菌異養(yǎng)高溫弱光恒濕,.,47,試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度、近100的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。,克服弱點，提高移栽成活率的措施,.,48,移栽前的準備,A.試管苗壯苗加入生長控制劑，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壯素），其作用是使苗粗壯，葉綠素增加。,.,49,B.試管苗煉苗,移栽前可將培養(yǎng)物不打開瓶口移到自然光照下鍛煉2-3d，讓試管苗接受強光的照射，使其長得壯實起來，然后再開口練苗1-3d，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應將來自然濕度的條件。,.,50,試管苗的移栽,試管苗的移栽要注意以下幾點;首先，要保持小苗的水分供需平衡。第二，要選擇恰當?shù)姆N植介質(zhì)，最要緊的是疏松透氣，適宜的保水性，容易滅菌處理，不利于雜菌滋生。常用的有粗粒狀蛭石、珍珠巖、粗沙、爐灰渣、谷殼(或谷殼灰)、鋸木屑等，或者將它們以一定的比例混合使用。第三，要防止菌類滋生。試管苗原來的環(huán)境是無菌的，種植出來以后難以保持完全無菌，但應盡量不使菌類大量滋生，以利于試管苗成活。第四，要注意一定的光、溫條件。一般強度較高的慢射光較好。第五，再生植株的鑒定：是指用細胞學或形態(tài)學等方法檢查再生植株是否有遺傳變異。,.,51,試管苗的移栽基質(zhì),泥炭,珍珠巖,椰糠,.,52,提高小苗移栽成活率的方法：,第一、將小苗分級第二、要進行煉苗第三、選好定植場所第四、要嚴格掌握移栽技術(shù)，科學確定合適的移栽時間第五、重視移栽后的管理,.,53,提高效益的措施,a.提高技能，提高生產(chǎn)效率；b.減少投資，延長設備使用壽命；c.實施簡化培養(yǎng)；d.節(jié)約水電。,.,54,5.3植物離體快速繁殖的影響因素,.,55,主要內(nèi)容,5.3.1影響組培苗快繁的內(nèi)因5.3.2影響組培苗快繁的外因,.,56,5.3.1影響組培苗快繁的內(nèi)因,5.3.1.1植物材料（外植體）的影響5.3.1.2繼代培養(yǎng)的次數(shù)5.3.1.3愈傷組織的遺傳特性及其生理狀態(tài)5.3.1.4植物離體分化過程類型的影響,.,57,5.3.1.1植物材料（外植體）的影響,外植體的影響包括：外植體的基因型、外植體的類型及其生理狀態(tài)、外植體的大小、取材植株的年齡及生理狀態(tài)等。在植物組織培養(yǎng)中，基因型的影響是非常突出的問題，可能原因：基因?qū)に匦枨笥幸欢ǖ目刂谱饔谩?.,58,在植物組織培養(yǎng)中一般來說增值能力草本木本；被子植物裸子植物；年幼材料老年材料；剛分離組織已繼代的組織；胚營養(yǎng)體組織；芽胚狀體愈傷組織。,.,59,5.3.1.2繼代培養(yǎng),(1)形態(tài)發(fā)生能力的保持或喪失；(2)培養(yǎng)中發(fā)生的變異(3)繼代培養(yǎng)時間長短(4)季節(jié),.,60,(1)形態(tài)發(fā)生能力的保持或喪失；,在大多數(shù)以頂芽或腋芽增殖方式繁殖的植物中，在培養(yǎng)許多代之后，仍然保持著旺盛的增殖能力，對于這種類型，似乎不大會出現(xiàn)形態(tài)發(fā)生能力削弱或喪失的問題，它們完全類似于常規(guī)的無性繁殖，只不過微型化了而已；采用細胞培養(yǎng)或愈傷組織培養(yǎng)的研究，需要關(guān)心著形態(tài)發(fā)生能力是否能持久。形態(tài)發(fā)生能力減弱或喪失大多由三個因素造成：,.,61,形態(tài)發(fā)生能力減弱或喪失大多由三個因素造成：,a.愈傷組織中含有從外植體啟動分裂時就包括進來的成器官中心(分生組織)，當重復繼代時會逐漸減少至喪失當它們不存在時，其它的愈傷組織難以再誘導形成成器官中心，這些愈傷組織不能形成維管束，而始終保持著無組織結(jié)構(gòu)的細胞分裂；b.形態(tài)發(fā)生潛力的喪失，可能是由于內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的減少；c.不正常染色體聚集可能會抑制發(fā)育過程。,.,62,(2)培養(yǎng)中發(fā)生的變異,培養(yǎng)中的細胞團，由于不斷的繼代使不正常植株產(chǎn)生的頻率增加，變異的范圍相當廣泛。表現(xiàn)型變異：葉形態(tài)變異，花青素顏色喪失，絨毛喪失，變侏儒，花的形態(tài)變異等；染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變可以產(chǎn)生變異；細胞核和細胞質(zhì)的基因突變；核外基因組的分離導致變異；非遺傳的生理適應變異。,.,63,(3)繼代培養(yǎng)時間長短,關(guān)于繼代培養(yǎng)次數(shù)對繁殖率的影響報道不一：有的材料長期繼代可保持原來的再生能力和增殖率，如葡萄；有的經(jīng)過一定時間繼代培養(yǎng)后才有分化再生能力，如沙棗；有的隨繼代時間加長而分化再生能力降低，如杜鵑。,.,64,(4)季節(jié),有些植物材料能否繼代與季節(jié)有關(guān)，主要原因是：繼代中有休眠現(xiàn)象。,.,65,5.3.1.3愈傷組織的遺傳特性及其生理狀態(tài),其影響主要通過：a、誘導愈傷組織進行離體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件均能影響愈傷組織的生理狀態(tài)，進而影響其再生能力b、愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間越久或代數(shù)越多，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，形態(tài)發(fā)生越困難c、體積大不利于分化一般選取生長旺盛的愈傷組織進行轉(zhuǎn)分化培養(yǎng),.,66,5.3.1.4芽的增殖途徑,芽及嫩梢的增殖是微繁的關(guān)鍵時期，芽的增殖途徑一般有一下5種：A、嫩梢扦插增殖途徑：又稱節(jié)培法或微型扦插法，由單芽莖段增殖成苗。特點：一次成苗，遺傳性狀穩(wěn)定，培養(yǎng)過程簡單，適用范圍大，移栽容易成活。主要適用:一些增殖培養(yǎng)比較困難，頂端優(yōu)勢明顯或生長迅速，或?qū)M培苗質(zhì)量要求比較高的木本植物。關(guān)鍵在于外植體芽位的選取B、叢生芽增殖型莖尖或初代培養(yǎng)的芽發(fā)生腋芽叢生芽。特點：遺傳性狀穩(wěn)定，莖尖培養(yǎng)，脫毒苗。適合于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，也是植物莖尖脫毒培養(yǎng)的必經(jīng)之路,.,67,5.3.1.4芽的增殖途徑,C、器官發(fā)生型從植物葉片、子房、花藥、胚珠、葉柄等誘導出愈傷組織；從愈傷組織上誘導不定芽。特點：可創(chuàng)造有益突變體，可能發(fā)生變異。D、胚狀體發(fā)生型從植物葉片、子房、花藥、胚珠、未成熟胚等誘導體細胞胚胎發(fā)生，其發(fā)生和成苗類似合子胚或種子。特點：胚狀體具有數(shù)量多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易成苗和繁殖速度快的特點，有變異。,.,68,5.3.1.4芽的增殖途徑,E、原球莖型原球莖是一種類胚組織，培養(yǎng)蘭花的莖尖或腋芽可直接產(chǎn)生原球莖，繼而分化成植株，也可繼代增殖為原球莖。特點：受材料的局限性較大。,.,69,5.3.2影響組培苗快繁的外因,5.3.2.1培養(yǎng)基對植物快速繁殖的影響5.3.2.2培養(yǎng)條件,.,70,5.3.2.1培養(yǎng)基對植物快速繁殖的影響,（1）無機鹽（2）糖濃度（3）維生素（4）生長素和細胞分裂素（5）其它有機化合物,.,71,（1）無機鹽,MS培養(yǎng)基可以適用于許多植物的組織培養(yǎng)。但在大量組織器官培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，由于其無機鹽濃度較高，對某些植物來說出現(xiàn)了抑制生長甚至毒害作用。此時應選用低鹽濃度的培養(yǎng)基，或降低鹽濃度的方法一試是很必要的。,.,72,（2）糖濃度,糖類具有維持培養(yǎng)基滲透壓的作用，在培養(yǎng)過程中，組織不斷地從培養(yǎng)基中吸取糖類物質(zhì)，隨時間增長，逐步降低了糖的濃度，不能維持正常的滲透壓，這種情況下應盡快將材料轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基，否則影響試管苗的生長。另外適宜的糖濃度對器官的發(fā)生也有重要作用。蔗糖在高壓滅菌時產(chǎn)生一種降解產(chǎn)物5-羥甲基糖醛，應引起重視。,.,73,（3）維生素,維生素主要是影響基礎的生物化學代謝，進而影響新陳代謝，并對形態(tài)發(fā)生產(chǎn)生影響。在培養(yǎng)過程中，所用的維生素類絕大多數(shù)為B族維生素，如硫胺素、煙酸、葉酸、生物素等，它們以各種輔酶的形式參與代謝活動，影響形態(tài)發(fā)生、分化及試管苗的生長。,.,74,（4）生長素和細胞分裂素,植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在試管苗增殖過程中起著決定性的作用。由于植物體內(nèi)源激素難以測定。因此，外源激素的加入靠一系列的試驗來修正。生長素和細胞分裂素對植物快速繁殖的影響主要表現(xiàn)在以下幾個方面:,.,75,激素對植物快速繁殖的影響,培養(yǎng)物對激素的需求量取決于它本身內(nèi)源激素的水平，這一水平又隨著植物種類、組織的部位以及生長期的條件而變動。有效地誘導一種植物產(chǎn)生苗或促進嫩莖良好地增殖，所要求的細胞分裂素和生長素的種類與數(shù)量有不少變化，通常只有一系列的預備實驗加以確定。植物組織和細胞對細胞分裂素的需求量，既取決于遺傳因素也取決于后天因素。生長素濃度過高，培養(yǎng)物表現(xiàn)發(fā)生旺盛生長的愈傷組織，細胞團較松散，出現(xiàn)水浸狀，細胞較大，液泡較大不可能分化出苗；生長素含量不足，組織塊幾乎不能生長；某些生長素如2,4-D用量過高，形態(tài)發(fā)生能力迅速喪失，或較長時間內(nèi)不能恢復；雙子葉植物要求較低，單子葉植物要求較高。,.,76,激素對植物快速繁殖的影響,因此，從實用的觀點出發(fā)，從比較迅速、簡便地達到快速繁殖的目的出發(fā)，只能是在現(xiàn)有的關(guān)于細胞的全能性知識，植物激素知識以及已分化成功的同種、同屬植物的經(jīng)驗等基礎上，用幾組不同的激素配比實驗進行試驗來解決問題。將大量試驗報告匯集之后，將會漸漸理出理論的輪廓。最終我們將發(fā)現(xiàn)，闡明細胞分化或不定芽發(fā)生，要比我們想象的復雜得多。,.,77,（5）其它有機化合物,因不同的原因和需要，用于培養(yǎng)基中的有機化合物，種類相當豐富。例如：氨基酸腺嘌呤肌醇促進植物組織的生長?；钚蕴?.,78,5.3.2.2培養(yǎng)條件,A、光照光照的主要作用是在形態(tài)建成的誘導方面，它涉及到植物細胞分化的若干重要過程。光是莖的發(fā)端和根生長的關(guān)鍵因子，在黑暗中培養(yǎng)的愈傷組織，當轉(zhuǎn)移到光下時便產(chǎn)生莖；光也抑制許多植物根的生長。光效應可再細分為光周期、光強度和光的波長，試管培養(yǎng)物在形態(tài)學上的需求，可由一至數(shù)個上述因子所滿足。,.,79,5.3.2.2培養(yǎng)條件,B、溫度不同植物增殖的最適溫度不同，大多采用252的溫度。C、氣體狀況試管苗生長和繁殖需要氧氣，進行固體培養(yǎng)時，如果瓶塞密閉或?qū)⒀柯袢肱囵B(yǎng)基會影響生長和繁殖；培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，瓶中可能有乙烯產(chǎn)生，高濃度的乙烯對正常的形態(tài)發(fā)生是不利因素。乙烯趨向于使培養(yǎng)的細胞無組織結(jié)構(gòu)的增殖。,.,80,5.4植物離體微繁過程中常見異?，F(xiàn)象及其對策,植物離體微繁過程中應注意的主要問題：1)遺傳穩(wěn)定性問題2)褐變問題3)玻璃化問題4)污染問題5)生產(chǎn)成本問題6)市場預測和經(jīng)營問題,褐變、玻璃化、菌類污染被稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題，因此，應該特別注意和重視。,.,81,5.4.1遺傳穩(wěn)定性問題,遺傳穩(wěn)定性問題，即保持原有良種特性問題。下面主要從三方面講述:A變異的起源及類型B影響遺傳穩(wěn)定性的因素C提高遺傳穩(wěn)定性，減少變異的措施,.,82,A變異的起源及類型,雖然植物組織培養(yǎng)中可獲得大量形態(tài)、生理特性不變的植株，但通過愈傷組織或懸浮培養(yǎng)誘導的苗木，經(jīng)常會出現(xiàn)一些體細胞變異個體，如：觀賞植物不開花、花小或花色不正；果樹植物不結(jié)果、抗性下降或果小；產(chǎn)量低.品質(zhì)差等問題，在生產(chǎn)上造成很大損失，并容易引起經(jīng)濟糾紛。綜合分析，變異的起源及類型如下:原來存在于外植體中的倍數(shù)性和遺傳組成不同的細胞經(jīng)誘導后產(chǎn)生新的植株；培養(yǎng)條件可能引起新的不規(guī)則性變異；前兩種原因同時發(fā)揮作用；染色體結(jié)構(gòu)變異、染色體數(shù)目變異、嵌合體、基因突變等。,.,83,B影響遺傳穩(wěn)定性的因素,基因型基因型不同，發(fā)生變異的頻率也不同。繼代次數(shù)試管苗的繼代培養(yǎng)次數(shù)和時間影響植物穩(wěn)定性，是造成變異的關(guān)鍵因素。一般隨繼代次數(shù)和時間的增加，變異頻率不斷提高。各種變異發(fā)生的頻率隨組織培養(yǎng)時間的增加而提高。發(fā)生方式離體器官發(fā)生有5種途徑，以莖尖、莖段等發(fā)生不定芽的方式繁殖不發(fā)生變異或變異率極低；花器(花瓣)誘導的變異較高；通過愈傷組織和懸浮培養(yǎng)分化不定芽的方式獲得再生植株變異率較高；通過分化胚狀體途徑再生植株變異較少；在高濃度的激素作用下，細胞分裂和生長加快，不正常分裂頻率增高，再生植株變異也增多。培養(yǎng)基改變其成分可誘導倍數(shù)性高的細胞分裂；多倍性與2,4-D有正相關(guān)性也有負相關(guān)性；物理狀態(tài)如半固體和液體可誘導產(chǎn)生多倍性。,.,84,C提高遺傳穩(wěn)定性，減少變異的措施,盡量采用不易發(fā)生體細胞變異的增殖途徑，以減少或避免植物個體或細胞發(fā)生變異。如采用生長點、腋芽生枝、胚狀體繁殖方式，可有效地減少變異縮短繼代時間，限制繼代次數(shù)，每隔一定繼代次數(shù)后，重新開始接外植體進行新的繼代培養(yǎng)；取幼年的外植體材料；采用適當?shù)纳L調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和較低的濃度；減少或不使用培養(yǎng)基中容易引起誘變的化學物質(zhì)；定期檢測，及時剔除生理、形態(tài)異常苗；確定再生植株的生理學性狀和經(jīng)濟性狀是否穩(wěn)定。,.,85,5.4.2褐變問題,植物組織培養(yǎng)中的褐變，是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化形成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不斷向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會抑制其他酶的活性，嚴重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象。這個問題分三方面講述:A）褐變的產(chǎn)生B）影響褐變的因素C）防止褐變的措施,.,86,A褐變的產(chǎn)生,褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物和多酚類氧化酶活性有直接關(guān)系：多酚氧化酶酚類化合物醌類物質(zhì)（褐色）+水,.,87,褐變的產(chǎn)生,正常情況下，完整的組織、細胞中，酚類化合物與多酚氧化酶分隔存在，因而穩(wěn)定；完整組織、細胞中的酚類化合物從外植體切口處溢出，是一種自我保護反應，可誘導植保素或物理屏障的形式，以防止微生物侵染組織；組織中的多酚氧化酶被激活，使酚類物質(zhì)被氧化產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì)而引起褐變。簡單地說:醌類物質(zhì)的產(chǎn)生，即產(chǎn)生褐變；醌類與外植體組織中的蛋白質(zhì)在酪氨酸酶的作用下發(fā)生聚合，引起其它酶系統(tǒng)失活，造成代謝紊亂生產(chǎn)停滯衰老死亡。,.,88,B影響褐變的因素,a植物材料b光照c溫度d培養(yǎng)基e培養(yǎng)方式,.,89,a植物材料,基因型不同種植物，同種植物不同類型，不同品種在組培中發(fā)生的頻率，嚴重程度有很大差別。木本植物、單寧含量或色素含量高的植物易發(fā)生褐變。酚類的糖苷化合物（前體物質(zhì)）：木質(zhì)素、單寧、色素材料年齡與生理狀態(tài)幼齡材料一般比成齡材料褐變輕；幼嫩組織比成熟組織褐變輕（酚類化合物含量少）；取材部位葡萄側(cè)生蔓切莖尖（酚類化合物含量少）比延長蔓切莖尖褐變輕；蘋果頂芽比側(cè)芽褐變輕。取材時期酚類化合物含量、多酚氧化酶含量隨季節(jié)變化而變化；外植體大小及受傷程度外植體大小、切口大小、外植體消毒用藥種類處理時間等。,.,90,b光照,取材之前的暗處理或弱光條件下，能控制外植體褐變，是因為酚類化合物的氧化過程中，需要許多酶系統(tǒng)，其中一部分酶系統(tǒng)的活性是受光誘導的，這些酶在自然光照條件下的植物體內(nèi)非?；钴S。初代培養(yǎng)進行暗處理，有一定的效果；有的處理無效果；有的處理反而加重褐變，原因：光下生長的植物內(nèi)酚類含量已經(jīng)很高，接種后放在黑暗中并不能馬上降低酚類含量，相反，連續(xù)黑暗會降低外植體生理活力，使褐變加重。,.,91,c溫度,低溫57，7天，可減輕褐變。,.,92,d培養(yǎng)基,培養(yǎng)基狀態(tài)：液體培養(yǎng)基可有效克服外植體褐變，再加上濾紙作為紙橋，效果會更好。原因：外植體溢出的有毒物質(zhì)可很快擴散。無機鹽降低鹽濃度則可減少酚類外溢，從而減輕褐變。原因：無機鹽中有些離子，如：Mn2+、Cu2+是參與氧化物酚類的組成或輔助因子。植物生長的調(diào)節(jié)劑6-BA或KT可促成酚類化合物，刺激氧化酶的活性，促進褐變發(fā)生；而生長素類如IAA、2,4-D延緩酚類合成，減輕褐變。,.,93,培養(yǎng)基,抗氧化劑加入抗氧化劑可改變外植體周圍的氧化還原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。如硫代硫酸鈉，蘇糖二硫醇、Vc、間苯三酚等?？寡趸瘎┰谝后w培養(yǎng)基中效果更好；外植體接種之前，用其浸泡一定時間可收到一定效果。吸附劑活性炭和PVP（聚乙烯吡咯烷酮）作為吸附劑可以去除酚類氧化造成的毒害效應（注意：吸附時也同時吸附生長調(diào)節(jié)劑）。螯合劑與酶螯合，降低酶活性。pH值低pH值，降低酶活性和底物利用率。,.,94,e培養(yǎng)條件與方式,外植體在最適宜的脫分化和再分化條件下，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，可減輕褐變。光照過強，溫度過高，培養(yǎng)時間過長，加速褐變。外植體在培養(yǎng)基中的放置方式：薯蕷的莖段，正向插入褐變較重；倒向插入褐變消失。培養(yǎng)方式通氣條件；轉(zhuǎn)瓶周期周期短，褐變輕。,.,95,C褐變的防止措施,三個選擇：分生能力強的外植體；合適的無機鹽成分濃度、合適的蔗糖濃度和激素水平；適宜的溫度、光照、pH等培養(yǎng)條件；兩個加入：活性炭(0.10.5%)抗氧化劑（VC、PVP、牛血清、牛蛋白等)；一個連續(xù)：連續(xù)將材料進行轉(zhuǎn)移。,.,96,5.4.3玻璃化問題,A玻璃苗的危害B影響玻璃苗發(fā)生的因素C玻璃苗中化學成分的變化D玻璃苗發(fā)生的機理E防止和克服玻璃苗的措施,.,97,A玻璃苗的危害,在進行植物組織培養(yǎng)時，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)試管苗生長異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長異常現(xiàn)象就是“玻璃化”。是植物組織培養(yǎng)過程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃苗中因其體內(nèi)含水量高、干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低，角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴大繁殖的材料；生根困難，移栽后也很難成活。,.,98,B影響玻璃苗發(fā)生的因素,瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負相關(guān)。培養(yǎng)基中6-BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)。非受傷的物理和化學脅迫可以增加乙烯的合成，乙烯促進了葉綠素分解及細胞的畸形發(fā)展，乙烯處理破壞了膜的結(jié)構(gòu)，隨著細胞壁解離，細胞內(nèi)積累有大量纖維及泡狀物質(zhì)，從而改變組織的生理生化及纖維結(jié)構(gòu)，導致了玻璃化的發(fā)生。因此，玻璃化被認為是一種非受傷脅迫條件下形態(tài)上的反應。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性低于正常植株。培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體與外界交換不暢。培養(yǎng)瓶中高的含N量，特別是高的N-NH4+。不同部位的節(jié)段外植體基部節(jié)段玻璃苗嚴重，莖尖最好。,.,99,C玻璃苗中化學成分的變化,纖維素和木質(zhì)素含量的變化玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量均低于正常苗。玻璃苗的莖尖段和莖基段中纖維素含量均低于正常苗。葉片和莖中纖維素和木質(zhì)素含量也均低于正常苗。造成玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量低的原因是試管苗發(fā)生玻璃化過程中，其體內(nèi)纖維素和木質(zhì)素合成下降，分解增加，尤其以莖尖段和葉片表現(xiàn)最嚴重。造成植物體內(nèi)纖維素和木質(zhì)素嚴重缺乏，從而表現(xiàn)為莖，葉呈水浸狀，生長不良等玻璃化現(xiàn)象。,.,100,礦質(zhì)元素含量的變化,a.多數(shù)元素在玻璃苗中的含量均低于正常苗，如：Cl、Au、Na、Sb、Mn、I、k、Fe、As、Zn、Ca、Mg、Co、Al、Br共16種。b.少數(shù)苗中Al、As、Br、Sb、Th、La等，培養(yǎng)基中不含這些元素推測它們主要來自瓊脂和蔗糖。c.玻璃苗中保衛(wèi)細胞中K元素含量比正常苗低，P、Al、Zn等元素含量則比正常苗高。,.,101,D玻璃苗發(fā)