多克隆抗體的制備

張江中試平臺(tái)陳偉偉,多克隆抗體的制備及抗體活性測(cè)定,主要內(nèi)容,多克隆抗體制備的基本原理多克隆抗體制備的操作步驟抗體活性的實(shí)驗(yàn)原理、操作流程和結(jié)果判斷,原理,1、克隆(clone)：是指無(wú)性繁殖細(xì)胞系，由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無(wú)發(fā)生突變其基因是完全相同的。2、多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。3、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)交叉反應(yīng)性。,第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動(dòng)物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonalantibody）；第二代抗體是通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來(lái)，稱為基因工程抗體(geneticengineeringantibody)。,抗體發(fā)展歷史,多克隆抗體制備流程,免疫原的制備免疫動(dòng)物免疫血清的收集免疫血清的鑒定免疫血清的保存,免疫原（immunogen）：指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）.免疫原種類：天然抗原、人工合成抗原；蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原。,免疫原的制備,細(xì)胞性抗原制備：綿羊紅細(xì)胞（SRBC）-溶血素；細(xì)菌-抗菌抗體（動(dòng)物免疫血清）?？扇苄钥乖苽洌褐傅鞍踪|(zhì)、多糖和脂類等。,細(xì)胞破碎,反復(fù)凍融法超聲破碎法自溶法酶處理法表面活性劑處理法,超速離心分離：是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過(guò)差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開(kāi)的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。選擇性沉淀：選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境，如：核酸去除鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法高分子聚合物沉淀法50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出血清球蛋白；8%12%PEG6000可沉淀IgG。,粗分離,超濾法：利用孔徑大小不同的特制薄膜對(duì)不同分子大小的抗原物質(zhì)進(jìn)行濾篩。電泳,精分離,層析法：凝膠過(guò)濾層析離子交換層析親和層析疏水層析反相層析,鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、純度以及免疫學(xué)活性。蛋白含量凱氏定氮（紫外光280nm等），Lowry分子質(zhì)量電泳、質(zhì)譜蛋白純度電泳、HPLC免疫原性免疫印跡、免疫雙擴(kuò)散、免疫組化蛋白活性ELISA、XTT蛋白結(jié)構(gòu)紅外光譜、氨基酸測(cè)序蛋白等電點(diǎn)IEF,蛋白鑒定,免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡(jiǎn)稱佐劑。,佐劑的種類佐劑一般包括以下幾類：無(wú)機(jī)佐劑：如氫氧化鋁、明釩等；生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等；人工合成佐劑：如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；納米佐劑,弗氏佐劑（Freundsadjuvant）分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動(dòng)物時(shí)，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。,佐劑與抗原混合乳化的方法：研磨法攪拌混合法,佐劑的免疫生物學(xué)作用增強(qiáng)抗原免疫原性：使無(wú)或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強(qiáng)的免疫原；增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。,佐劑的作用機(jī)制佐劑的作用機(jī)制歸納起來(lái)主要有如下幾種：可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性。佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲(chǔ)存庫(kù)，延長(zhǎng)抗原在局部組織的滯留時(shí)間，有利于抗原的緩慢釋放。增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對(duì)抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。,動(dòng)物免疫,免疫動(dòng)物的選擇：抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬的關(guān)系：抗原的來(lái)源與免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。動(dòng)物個(gè)體的選擇：適齡、健康、體重符合要求的正常動(dòng)物（以雄性為佳）；抗體需要量少時(shí)，選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物；抗體需要量大時(shí)，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動(dòng)物。,免疫方法選定動(dòng)物后，在免疫過(guò)程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間來(lái)確定。首次免疫時(shí)，劑量不宜過(guò)大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。,免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對(duì)于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。,免疫間隔時(shí)間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時(shí)間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時(shí)間一般為710天，若間隔時(shí)間太長(zhǎng)，則刺激減弱，抗體效價(jià)不高。,動(dòng)物采血,采集免疫血清前，要預(yù)先測(cè)試抗體效價(jià)測(cè)定，若效價(jià)達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)會(huì)下降。頸動(dòng)脈采血法心臟采血法靜脈采血法,免疫血清的鑒定,表達(dá)量的測(cè)定：顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。玻片凝集試驗(yàn)肥達(dá)試驗(yàn)（微量法）ELISA,玻片凝集試驗(yàn),玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn)方法，一般用已知抗體作為診斷血清、與受檢顆粒抗原如菌液或紅細(xì)胞懸液各加1滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)。此法簡(jiǎn)便、快速，一般用來(lái)鑒定菌種或分型，也用于人類ABO血型的鑒定。,肥達(dá)試驗(yàn)（Widaltest）是用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人血清做定量凝集試驗(yàn)，以測(cè)定患者血清中有無(wú)相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以及增長(zhǎng)情況判斷陽(yáng)性。此法一般用來(lái)幫助診斷傷寒及副傷寒。,肥達(dá)試驗(yàn),ELISA,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。,特異性鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。純度鑒定：抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。結(jié)合活性鑒定：測(cè)定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)等。,抗體親合常數(shù)測(cè)定親合常數(shù)測(cè)定采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫試驗(yàn)法：先確定在某一抗原濃度時(shí)抗體可以達(dá)到飽和；以該抗原濃度為實(shí)驗(yàn)條件，飽和時(shí)的OD值作為OD-100，找出OD-50時(shí)的抗體濃度和相應(yīng)的抗原濃度；根據(jù)公式Ka=n-1計(jì)算抗體的Ka值。2(nAbt-Abt)t代表測(cè)定時(shí)的溫度；n=Abt/Abt；Abt表示抗原濃度較高的Amax的一半；Abt表示抗原濃度較低的Amax的一半。對(duì)于單克隆抗體，一般親合力要求107L/mol，好的單抗多大于109L/mol。,多克隆抗體的保存,4保存（6個(gè)月）低溫保存（-70-20，5年）真空干燥保存（510年）注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌保存液含防腐劑避免反復(fù)凍融（分裝）,半抗原性免疫原的制備載體選擇：（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體。,連接方法：物理法：是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過(guò)電荷和微孔來(lái)吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學(xué)法：是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到蛋白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進(jìn)行連接。,根據(jù)化學(xué)基團(tuán)不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連