生物化學蛋白質的共價結構PPT課件

.,1,Biochemistry生物化學,.,2,第4章蛋白質的共價結構,一、蛋白質通論二、肽三、蛋白質一級結構的測定四、蛋白質的氨基酸序列與生物功能五、肽和蛋白質的人工合成,(Covalentstructureofprotein),.,3,一、蛋白質通論,蛋白質的化學組成,碳50%氫7%氧23%氮16%硫03%其它（P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn、Ca等）,.,4,定氮法測定蛋白質含量,氮為蛋白質的特征元素，將提取并純化的蛋白質用凱氏定氮法測定氮的含量，然后通過下列公式可以計算蛋白質的含量：蛋白質含量（mg/ml）=蛋白氮（mg/ml）6.25（或=蛋白氮（mg/ml）16%）,.,5,蛋白質的分類,僅由氨基酸縮合而成，不含其它成分的蛋白質叫單純蛋白質（simpleprotein）；還含有其它成分的蛋白質叫綴合蛋白質（conjugatedprotein），綴合蛋白質中的非蛋白質成分叫配體（ligand），有些配體與蛋白質通過共價鍵結合，有些通過非共價鍵結合。,.,6,蛋白質的分類,蛋白質還可以：按溶解性質分類（見P158表4-1）按所含配體種類分類（見P158表4-2）按生物學功能分類（見P158表4-3）,.,7,蛋白質的形狀,纖維狀蛋白質球狀蛋白質膜結合蛋白質,CollagenMyoglobinBacteriorhodopsin,.,8,蛋白質的大小,.,9,蛋白質的大小,蛋白質的分子量很大，并且分布范圍也很大，一般在大約60001106道爾頓。蛋白質的分子量主要由組成蛋白質的氨基酸殘基的數目決定，對于綴合蛋白質來說，有些配體也在蛋白質的分子量中占有很大的比重。蛋白質的分子量范圍是人為規(guī)定的，更小的氨基酸縮合物叫做肽。,.,10,蛋白質氨基酸殘基數的估計,對于簡單蛋白質，用110除它的相對分子量即可約略估計出其氨基酸殘基數目。20種常見氨基酸的平均分子量為138組成蛋白質的氨基酸的平均分子量為128每個氨基酸殘基的平均分子量為110,.,11,蛋白質結構的組織層次,一級結構指的是多肽鏈的氨基酸序列二級結構指的是多肽鏈借助于氫鍵排列成有規(guī)律的、局部的結構三級結構是指多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象四級結構指的是寡聚蛋白質亞基間的結合，亞基間不同的排列方式會形成不同的構象。,.,12,Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu,蛋白質的一級結構,SS,N端,C端,.,13,蛋白質的二級結構,“Shorthand”-helix“Shorthand”-strand,.,14,蛋白質的三級結構,Chymotrypsinspace-fillingmodelChymotrypsinribbon,.,15,蛋白質的四級結構,.,16,蛋白質的一級結構決定高級結構,在肽鏈內或肽鏈間有時也有兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵的連接。,.,17,蛋白質功能的多樣性,1催化；2調節(jié)；3轉運；4貯存；5運動；6結構成分；7支架作用；8防御和進攻；9異常功能。,.,18,二、肽,肽的命名,肽是兩個至數百個氨基酸之間由肽鍵連接而成的線狀聚合物。根據形成肽的氨基酸數目，一般氨基酸數目在12個以內時，稱為二肽、三肽、四肽等；13個至20個時稱為寡肽（oligopeptide）；20個以上稱為多肽（polypeptide）。當分子量大到一定程度時，就稱為蛋白質。寡肽和多肽的區(qū)分完全是人為規(guī)定的，其間的界限并不嚴格。肽鏈中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基酸殘基。,.,19,肽的兩端,一條肽鏈是有方向性的，肽鏈的一端具有游離的氨基，稱其為N端；另一端具有游離的羧基，稱其為C端。有少數小分子量的肽，其首尾也縮合成肽鍵，成為環(huán)肽。,.,20,肽的命名,對于小分子量的肽的命名，是從其N端開始，稱為某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸，下例寫成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左邊是N端，右邊是C端。,.,21,肽的命名,對于生物體內的具有特定結構和功能的小分子量肽，還有特別名稱，如腦啡肽、內啡肽、催產素、加壓素等。,.,22,肽基的C、O和N原子間的共振相互作用,.,23,肽鍵共振的結果,限制肽鍵的自由旋轉，給肽主鏈的每一個氨基酸殘基只保留兩個自由度。組成肽基的4個原子和2個相鄰的C原子傾,向于共平面，形成所謂的多肽主鏈的酰胺平面（amideplane）或稱肽平面（peptideplane）。,肽平面,.,24,肽鍵共振的結果,CN鍵的長度為0.133nm，比正常的CN單鍵（0.145nm）短，但比典型的C=N鍵（0.125nm）長。估計肽基中的CN鍵具有約40%的雙鍵性質，而C=O鍵具有40%的單鍵性質，在室溫下足以防止CN鍵旋轉。雜化的中間態(tài)酰胺帶有0.28個凈正電荷，羰基帶有0.28個凈負電荷，肽鍵具有永久偶極。,.,25,肽基的順、反構型,肽平面內，兩個C可以處于順式或反式構型。因為順式構型兩個R基有空間位阻，所以反式構型比順式構型穩(wěn)定，因此肽鏈中肽鍵幾乎都是反式構型。,.,26,脯氨酸的亞氨基形成的肽鍵,OfthepeptidebondsbetweenaminoacidresiduesotherthanPro,over99.95%areinthetransconfiguration.Forpeptidebondsinvolvingtheiminonitrogenofproline,however,about6%areinthecisconfiguration;manyoftheseoccuratturns.,transcis,.,27,肽的物理化學性質,由于短肽晶體的熔點都很高，說明短肽的晶體是離子晶格，在水溶液中以偶極離子存在。在pH014范圍內，肽鍵中的酰胺氫不解離，所以肽的酸堿性主要決定于肽鏈末端的羧基、氨基以及R基團上的可解離基團。因為肽鏈末端的羧基和氨基相距很遠，它們之間的靜電引力較弱，所以它們的酸堿性比氨基酸的羧基和氨基弱。R基上可解離基團的解離常數也有所變化。在某一pH下，肽中各可解離基團解離得到的凈電荷為0，這個pH就是該肽的等電點。,.,28,肽的物理化學性質,肽的化學反應和氨基酸的一致。N端的氨基酸殘基也可以與茚三酮反應，這一反應可用于肽的定性和定量測定。雙縮脲反應是肽和蛋白質特有的，氨基酸沒有此反應。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色或藍紫色的復合物，利用這個反應可以用分光光度法（540nm）測定蛋白質的含量。,.,29,雙縮脲與肽的結構比較,雙縮脲,三肽,.,30,三、蛋白質一級結構的測定,蛋白質測序的策略,首先要得到較純的蛋白質樣品，純度應在97%以上。測出它的分子量。分析蛋白質中是否有非肽成分。測定蛋白質分子中的多肽鏈的數目。拆分多肽鏈。測定肽鏈的氨基酸組成。鑒定肽鏈的C末端氨基酸及N末端氨基酸。,.,31,蛋白質測序的策略,酶水解肽鏈成短的肽段。采用兩套以上的酶水解方法，得到互相重疊的肽段。分離純化這些肽段，并鑒定各肽段的C末端氨基酸及N末端氨基酸。測定各肽段的序列。確定天冬酰胺、谷氨酰胺以及鏈內或鏈間二硫鍵的位置。拼出完整肽鏈的序列。,.,32,N末端分析,二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger試劑）與肽鏈N末端的氨基反應，生成DNP多肽或DNP蛋白質。然后水解肽鏈，分離得到DNP氨基酸，紙層析、薄層層析或HPLC分離鑒定。丹磺酰氯法（DNS法）：與DNFB法類似，由于丹磺酰氯有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍。,DNP-氨基酸,.,33,N末端分析,苯異硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽鏈與PITC（Edman試劑）反應生成PTC多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC蛋白質，在酸性有機溶劑中加熱時，N末端的PTC氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并從肽鏈上脫落下來，除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的。分離PTH氨基酸并鑒定。肽鏈可用于鑒定下一個氨基酸，所以此法可以用于測序。氨肽酶法：根據游離氨基酸出現的時間順序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有時難以分析。,PTH-氨基酸,.,34,C末端分析,肼解法：蛋白質或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解。反應中除C末端氨基酸以游離形式存在外，其它氨基酸都轉變成相應的氨基酸酰肼。反應中生成的氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游離的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鑒定。肼解過程中，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破壞不易測出，精氨酸轉變成鳥氨酸。,.,35,肼解法反應式,.,36,C末端分析,還原法：肽鏈C末端的氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應的氨基醇，肽鏈水解后層析鑒定。,.,37,C末端分析,羧肽酶法：目前常用的有4種羧肽酶：A、B、C和Y。羧肽酶A能釋放除Pro、Arg和Lys之外的任何一種C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以堿性氨基酸Arg和Lys為C末端的氨基酸；羧肽酶C和Y可以釋放任何一種C末端氨基酸。,-Val-Ser-Gly,.,38,二硫橋的斷裂,先加8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白質變性，再用氧化法或還原法斷裂二硫鍵。還原法產生的巰基要用烷基化試劑如碘乙酸保護起來，以免重新形成二硫鍵。,碘乙酸保護,.,39,還原法斷裂二硫橋,.,40,氧化法斷裂二硫橋,過甲酸,.,41,氨基酸組成的分析,酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，堿水解分析色氨酸。為了準確分析酸水解中被部分破壞的Ser、Thr、Tyr、Cys的量，酸水解24、48、72小時后，分析這些氨基酸的量，然后外推至0時得到這些氨基酸不被破壞時的量。分析酸水解液中NH3的量，得出有多少個Asn+Gln。氨基酸的分析：離子交換柱層析分離，茚三酮染色，比色定量。,.,42,某些氨基酸含量隨水解時間的變化,易被破壞的氨基酸采用外推法測定,疏水氨基酸難以水解，采用極限法測定,.,43,氨基酸分析儀示意圖,加熱,.,44,氨基酸分析儀示意圖,長柱用于分離酸性和中性氨基酸,短柱用于分離堿性氨基酸和氨,柱中填料為細粒聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂,.,45,氨基酸的離子交換柱層析圖譜,洗脫曲線,.,46,多肽鏈的部分裂解,酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等，它們各自有自己的水解專一性。蛋白酶分為內肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。化學裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽鍵）、羥胺（裂解Asn-Gly之間的肽鍵，也能部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala之間的肽鍵）。,.,47,蛋白酶的專一性,AECys,.,48,溴化氰裂解法,溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽鍵,.,49,肽段的分離純化,凝膠過濾凝膠電泳高效液相色譜,.,50,氨基酸序列測定,質譜法：兩臺質譜儀聯用，第一臺質譜儀通過電噴射電離使肽段帶上電荷，將不同大小的肽段分離。第二臺質譜儀分析肽段的序列。在第二臺質譜儀上，小肽段在碰撞池中與氮氣分子或氬氣分子碰撞，碎裂成依次少一個氨基酸殘基的碎片，分析這些碎片的質量差，可得出序列。,.,51,串聯質譜儀,.,52,串聯質譜測序工作原理,分離肽段,測序,.,53,氨基酸序列測定,Edman降解法：由N端向C端逐步降解。先將被測肽段的羧基端固定到不溶性的樹脂上，便于分離切下的氨基酸和剩余的肽段。酶降解法：用外肽酶逐個切下氨基酸分析。只能分析很少的幾個氨基酸。根據核苷酸序列的推定法：找到該蛋白質的基因，從基因的編碼序列按三聯密碼推出氨基酸序列。,.,54,所得資料：N-末端殘基HC-末端殘基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推斷全序列HOWTOUSEOVERLAPS,肽段在多肽鏈中次序的決定,.,55,二硫橋位置的確定,在保留二硫橋的情況下對蛋白質部分水解，利用對角線電泳可以鑒定出哪些肽段帶有二硫橋。對角線電泳是雙向電泳，把水解后的肽段混合物點到濾紙的中央，第一向將肽段按大小和帶電荷情況分離，然后把濾紙暴露到過甲酸蒸氣中，使二硫橋斷裂，再在同樣的條件下進行第二向電泳。,.,56,對角線電泳,.,57,對角線電泳,.,58,二硫橋位置的確定,二硫橋連接的兩個肽段在第一向時是一個斑點，第二向時成了兩個斑點，并離開對角線。對這兩個斑點相對應的肽段進行測序，如果兩個肽段中各只有一個Cys，它們就是參與二硫橋的Cys。根據這兩個肽段的序列，可知它們在整個肽鏈中的位置。,.,59,酰胺位置的確定,對肽鏈進行各種部分水解，直到測得一個肽段中只有1個天冬酰胺或谷氨酰胺為止。,.,60,四、蛋白質的氨基酸序列與生物功能,有些來源于不同生物的蛋白質的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種序列上的相似性叫做同源性。同源蛋白質中有許多氨基酸殘基是相同的，稱為不變殘基，或保守性殘基，而在不同物種的同源蛋白質中不同的氨基酸殘基稱為可變殘基。親緣關系越近的同源蛋白質的同源性越強。同源蛋白質往往在不同生物體中行使相同或相似的功能，例如各種脊椎動物體內的血紅蛋白就屬于同源蛋白質。,.,61,細胞色素C,細胞色素C是一種含血紅素的蛋白質，在線粒體中起電子傳遞的作用。大多數細胞色素C含一百,零幾個氨基酸殘基，40多個物種的細胞色素C氨基酸序列分析表明，有28個殘基是不變的，所有細胞色素C在第17位上都是一個Cys殘基，這個殘基是血紅素結合的部位。,.,62,細胞色素C的不變殘基,.,63,不同物種細胞色素C的差異殘基數,.,64,根據細胞色素C建立的系統(tǒng)樹,哺乳類,鳥和爬蟲類,硬骨魚類,軟骨魚類,真菌,昆蟲,兩棲類,植物,.,65,氧合血紅素蛋白質,肌肉中的氧合血紅素蛋白質肌紅蛋白（Myoglobin）由一條肽鏈組成，含153個氨基酸殘基，紅細胞中的血紅蛋白（Hemoglobin）是一個由兩條鏈（每條鏈141個氨基酸殘基）和兩條鏈（每條鏈146個氨基酸殘基）組成的四聚體蛋白。肌紅蛋白、血紅蛋白的鏈和鏈都是珠蛋白（globin），它們有很高的序列同源性，通過血紅素結合氧的能力都被這3種多肽鏈保留下來了。,.,66,氧合血紅素蛋白的進化樹,.,67,絲氨酸蛋白酶類,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶以及纖溶酶都是絲氨酸蛋白酶，它們有足夠的序列同源性，在它們的活性中心都有絲氨酸，說明它們可能是由祖先絲氨酸蛋白酶進化而來。,.,68,生物活性和來源差異很大的蛋白質,卵清中的溶菌酶（含129個殘基，水解細菌細胞壁的多糖成分）和人乳汁中的-乳清蛋白（含123個殘基，調節(jié)乳糖合成）功能和來源