實(shí)驗(yàn)六抗體效價(jià)的Elisa測(cè)定.ppt

1、實(shí)驗(yàn)二 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BSA抗體效價(jià) 1.目的要求 (1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理。 (2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，抗體的效價(jià)測(cè)定及酶聯(lián)免疫測(cè)定儀的使用。,2.基本原理 免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，定量測(cè)定Ab/Ag。 免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次 具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng) 酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次 顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg,60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過(guò)氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗體

2、，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測(cè)定,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay簡(jiǎn)稱為Elisa)-是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強(qiáng)兩方面的優(yōu)點(diǎn)。,1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合 操作更方便，易重復(fù) 靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，,(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),免疫標(biāo)記技術(shù),應(yīng)用各種液

3、相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定,標(biāo)記抗體或抗原,熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑,鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定,熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等,直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究,酶-性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無(wú)色、產(chǎn)物顯色，便于檢測(cè) 常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過(guò)氧化物酶(horserad peroxidase簡(jiǎn)稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。,酶標(biāo)技術(shù),戊二醛法， 過(guò)碘酸氧化法 將酶與Ab交聯(lián)在一起,Ag-Ab-抗Ab-HRP,TMB+H2O2,產(chǎn)

4、物（黃色，OD450)+H2O,圖一直接型Elisa,圖二間接型Elisa,圖三 雙抗體夾心型ELISA,圖四 固相抗體競(jìng)爭(zhēng)型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2）,每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？ 保證反應(yīng)的定量反應(yīng) 防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。,Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will conta

5、in antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.,HIV (human i

6、mmunodeficiency virus) detection,positive,negative,Protein protein interaction-ELISA,1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein -,2.Competitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and va

7、rious concentration prey protein,4. 操作方法 4.1 包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Og/ml，每凹孔加100L，加蓋置4過(guò)夜(37 2h)【已完成】 次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿稀釋/洗滌液洗滌3次，首次洗滌靜置2min后傾去，后兩次靜置1min。將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。 4.2 封閉: 每孔中加滿封閉液（約300ul多），加蓋或用封口膜封板，置37恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。,4.3 加待測(cè)血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無(wú)抗體)及稀釋液(PBS/Tween): 待測(cè)血清按倍比法用稀釋液

8、稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測(cè)血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。,4.4 加酶標(biāo)抗體:加入HRP-抗體(抗抗體，本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)稀釋一千倍)，每孔加l00L，封板后置37溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。 4.5 顯色: 首先按每10mLOPD應(yīng)用液加入0.15mLH2O2處理。每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處530min。當(dāng)顯示明顯黃色時(shí)應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)。 4.6 終止反應(yīng)

9、:每孔加入10OL 2mol/L H2SO4。由黃色變?yōu)槌壬?。穩(wěn)定35min即可比色測(cè)定。,4.7 檢測(cè): 用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，以PBS/Tween孔為對(duì)照、測(cè)波長(zhǎng)為49Onm時(shí)各孔光吸收（A）。 計(jì)算陽(yáng)性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當(dāng)P/N2.1時(shí)為陽(yáng)性，P/N2.1而1.5為可疑，P/N1.5為陰性。用目測(cè)法則以較陰性對(duì)照深色的最高稀釋度作為抗體效價(jià)。 用“”“”表示，超過(guò)規(guī)定吸收值（0.20.4）的標(biāo)本均屬陽(yáng)性。,注意事項(xiàng) (1)聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1100g之間，在偏堿條件下易

10、吸附于反應(yīng)板的凹孔中，4放置過(guò)夜較理想，若暫時(shí)不用，可加入終濃度為0.02% NaN3，4貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個(gè)月以上不影響測(cè)定效果。 (2)反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時(shí)間，切忌相互污染。 (3)為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致，終止反應(yīng)35min后應(yīng)立即比色。必要時(shí)可設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，以固定顯色及終止時(shí)間。 (4)待測(cè)抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無(wú)法結(jié)合。,自動(dòng)酶標(biāo)儀（Elx800UV）使用程序 1 開(kāi)機(jī)，進(jìn)行System self-test 2 按“DEFINE”鍵

11、，進(jìn)入“SELECT ASSAY NUMBER”， 用“NUMERIC”或“OPTION”鍵輸入測(cè)試號(hào)（注：assay 01 為quick read，最大測(cè)試號(hào)為55）；按“ENTER”鍵修改測(cè)試的“NAME”；再按“ENTER”鍵進(jìn)入下列菜單： 按“METHOD”鍵選擇測(cè)試的波長(zhǎng)類(lèi)型（Single或Dual）、波長(zhǎng)大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板類(lèi)型(96孔、48孔或24孔)。 按“MAP”鍵選擇閱讀方式(Auto或Manual) 、閱讀方向（Down或Across）、重復(fù)方向（Down或Across）、閱讀起始位置（輸入編號(hào)）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。,3 按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進(jìn)入儀器，開(kāi)始讀數(shù)并計(jì)數(shù)，打印機(jī)輸出數(shù)據(jù)。 4 按