固定化解脂耶氏酵母菌處理含油廢水的工藝條件摸索-環(huán)境工程學(xué)報(bào)

1、w擬再審修改稿200708050固定化解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）處理油脂廢水的性能研究吳蘭1,2, 萬金保2*（1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330047；2. 南昌大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院、教育部鄱陽湖湖泊生態(tài)暨生物資源利用實(shí)驗(yàn)室， 南昌 330047） 摘 要 以海藻酸鈉為固定化載體材料，以氯化鈣作為交聯(lián)劑，將高效降解油脂菌解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）包埋制備成固定化微生物小球，用以處理油脂廢水，考察了最佳處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，解脂耶氏酵母經(jīng)固定化包埋后處理色拉油廢水的最適條件為：溫度2535、pH48、搖床轉(zhuǎn)速100200r/min，處

2、理初始油濃度在2000mg/L，包埋菌濃度6.65106個(gè)/mL，包埋量為4mL/150L。與懸浮狀態(tài)相比，固定化微生物溫度適應(yīng)范圍增大、熱適應(yīng)性增強(qiáng)、pH值往酸性方向偏移。將固定化解脂耶氏酵母投入YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)馴化30 h再處理色拉油廢水，結(jié)果顯示：馴化后的固定化微生物在同樣條件下對色拉油的降解率達(dá)到82%，比未馴化狀態(tài)高20%，且馴化后的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性和重復(fù)使用性都有明顯改善。關(guān)鍵詞 固定化、海藻酸鈣、解脂耶氏酵母、油脂廢水中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào)Investigation on the capability of disposing the grease wastewa

3、ter with Immobilized Yarrowia lipolyticaWu Lan1,2 ， Wan Jinbao2*（1.The college of Life Science, Nanchang University, Nanchang 3300472.The college of Environmental Science and Engineering, Nanchang University; Key Labof Poyang Lake Ecology and Bio-resource Utilization ，Nanchang University，Ministry of

4、 Education, Nanchang 330047）Abstract The optimal conditions have been studied in disposing the grease wastewater with predominant disposing oil bacteriaimmobilized Yarrowia lipolytica embedded into 基金項(xiàng)目：江西省教育廳科研項(xiàng)目資助作者簡介：吳蘭（1969-），女，副教授、博士研究生，主要從事環(huán)境微生物研究工作 E-mail:W. *責(zé)任作者microorgani

5、sms when using sodium alginate as immobilized carrier and calcium chloride as crosslinker. The results show that the optimal conditions of disposing salad oil for immobilized Yarrowia lipolytica are: temperature 2530 , pH 48, the shaking speed 100200 r/min, primary oil concentration 2000 mg/L, embed

6、ded bacteria concentration 6.65106 entries/mL, embedding quantity 4mL/150L. In contrast with suspended bacteria, the embedded microorganisms represent more adaptable capability of a larger range of temperature and an enhancement of heat resistance，a pH avertion to acidity. The result of plunging the

7、 immobilized Yarrowia lipolytica into YPD liquid substrate to domesticate for 30 h before disposing salad oil shows that: after domestication, disposing rate of salad oil for the immobilized microorganisms can be 82%, with an increase of 20% compared with the ones that havent been domesticated with

8、the same condition, furthermore, the mechanical strength，the stability and the repetition for utilization are promoted obviously.Key words: immobilization、sodium alginate、Yarrowia lipolytica、rease wastewater油脂廢水是工業(yè)生產(chǎn)中污染較為嚴(yán)重的一類廢水,具有量大且面廣的排放特點(diǎn)。為此許多國家制定了限制油脂廢水排放的政策，并發(fā)展了多種降低油脂廢水污染的技術(shù)方法，其中從自然界中篩選分離能高效降解油

9、脂的微生物，培養(yǎng)后投加到污水處理系統(tǒng)中進(jìn)行油脂廢水的處理成為研究熱點(diǎn)。但投加的菌量容易流失，性質(zhì)不穩(wěn)定，廢水中的其它物質(zhì)對菌體細(xì)胞具有毒性等限制了生物降解法在油脂廢水中的廣泛應(yīng)用。固定化微生物技術(shù)因其具有降解廢物效率高、可循環(huán)使用、穩(wěn)定性強(qiáng)、固液分離容易、占地面積小等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們重視1。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一株高效降解油脂菌，其降解油脂的性能、工藝條件均得到了較好的研究2,3。為進(jìn)一步拓展該菌株在油脂廢水處理系統(tǒng)中的運(yùn)用，本實(shí)驗(yàn)擬將該菌固定化，摸索固定化解脂耶氏酵母處理油脂廢水的工藝條件，通過對固定化微生物的降油脂性能進(jìn)行測試與研究來探討該技術(shù)目前存

10、在的問題及解決的途徑。1. 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種解脂耶氏酵母W29由本研究室保藏1.1.2 化學(xué)試劑海藻酸鈉、無水氯化鈣、石油醚（沸程3060）、無水硫酸鈉、無水乙醇等均為分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。1.1.3 培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基，配方如下，1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、pH自然1.1.4 廢水來源實(shí)驗(yàn)室自配廢水，將色拉油（市場購買）配置成不同濃度的經(jīng)滅菌處理的油脂廢水。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1解脂耶氏酵母的活化與培養(yǎng)將保存的解脂耶氏酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度30、轉(zhuǎn)速160r/min搖床上培養(yǎng)18h，傳代使之活化，4保藏備實(shí)驗(yàn)用。1.2

11、.2固定化微生物的制備以海藻酸鈉為載體采用包埋法制備固定化微生物。具體過程：將一定量的已活化的菌懸液加入到4%的海藻酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢璧渭拥?%的氯化鈣交聯(lián)劑中，4交聯(lián)24小時(shí)后待用 4 。1.2.3油含量的測定 采用重量法測定(國標(biāo)CJ/T 57-1999)51.2.4降解率的計(jì)算 降解率=(起始油含量最終油含量)/起始油含量100%1.2.5接種菌濃度記數(shù) 采用血球記數(shù)板記數(shù)法2 結(jié)果與討論2.1解脂耶氏酵母菌的生長曲線 在最佳條件下2，將活化的解脂耶氏酵母菌培養(yǎng)在2000mg/L的色拉油廢水中，解脂耶氏酵母菌的生長特征以600nm波長處測得的OD值來描述6，實(shí)驗(yàn)每隔5h取樣測定，結(jié)果見

12、圖1。圖1 解脂耶氏酵母菌的生長曲線Fig.1 The growth of Yarrowia lipolytica 結(jié)果表明：解脂耶氏酵母菌能以色拉油為唯一碳源進(jìn)行生長，且生長分為四個(gè)時(shí)期。從0到5h時(shí)為延遲期，OD值僅為0.0225；5h至20h是解脂耶氏酵母菌的對數(shù)生長期，OD值從0.0225迅速增加到了1.119；20h至35h為生長的穩(wěn)定期；自35h后細(xì)胞進(jìn)入了衰亡期，OD值減少，但前期細(xì)胞的衰亡速度較慢，從35h到50h，OD值僅從1.137變化為0.996，通過對解脂耶氏酵母菌生長周期的了解，在對微生物進(jìn)行固定化時(shí)，采用其對數(shù)生長期的菌液加以包埋以保證細(xì)胞的最大活性。2.2 溫度對

13、固定化解脂耶氏酵母菌降解油脂廢水的影響 將包埋菌量為4 mL的固定化解脂耶氏酵母和等量的菌懸液分別投入2000mg/L、5000 mg/L的150mL色拉油廢水處理50 h，在pH自然、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下，考察不同的溫度對油脂降解率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：固定化和游離的解脂耶氏酵母菌對色拉油的降解效率在30時(shí)均達(dá)到最大，表明固定化和游離的解脂耶氏酵母菌處理色拉油廢水的最適溫度相同，結(jié)果與張建輝7的研究相一致。但游離菌株處理色拉油的適宜溫度范圍為2530，而固定化微生物降解色拉油的適宜溫度范圍為2535，表明固定化菌株處理油脂廢水的適宜溫度范圍更廣。當(dāng)溫度大于30時(shí)，固定化

14、與游離菌株對色拉油的降解效率均隨著溫度的升高而降低，但游離菌的降解圖2 溫度對固定化解脂耶氏酵母降解含油廢水的影響Fig.2 The effect of temperature on degradation of immobilized Yarrowia lipolytica效率下降速率更快，溫度從30變化為40時(shí)，游離菌對色拉油廢水的降解率下降了38%，而固定化菌株對色拉油的降解率僅下降了7%，暗示固定化解脂耶氏酵母菌比游離細(xì)胞有著更好的熱適應(yīng)性。2.3 初始pH對固定化菌株降解油脂廢水的影響 將等量的固定化和游離解脂耶氏酵母菌分別處理濃度為2000mg/L、5000 mg/L的150mL色

15、拉油廢水50 h，在溫度為30，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，改變實(shí)驗(yàn)的初始pH，結(jié)果見圖3。圖3 pH對固定化解脂耶氏酵母降解含油廢水的影響Fig.3 The effect of pH on degradation of immobilized Yarrowia lipolytica 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：pH68是固定化和游離解脂耶氏酵母處理色拉油廢水的最適pH范圍，在這個(gè)pH范圍內(nèi)固定化和游離細(xì)胞對色拉油的降解率均達(dá)到最大，研究表明雖然起始廢水的pH不同，但廢水經(jīng)固定化和游離細(xì)胞處理后，其pH最終均達(dá)到4左右，但游離菌比固定化菌對色拉油的降解率高13%左右。圖2顯示游離解脂耶氏酵母在初始pH610

16、范圍內(nèi)對色拉油都有著較好的降解效果，降解率維持在60%以上，表明解脂耶氏酵母能很好地適應(yīng)中性偏堿的環(huán)境；細(xì)胞經(jīng)固定化后，其適宜pH范圍為48，往酸性環(huán)境偏移，表明細(xì)胞被固定后，它的抗酸性能力提高。當(dāng)pH8時(shí)，固定化微生物的除油率迅速降低，到pH=10時(shí)，固定化微生物對色拉油的降解率僅為13.7%，表明極端的堿性環(huán)境不利于固定化解脂耶氏酵母降解油脂。2.4搖床轉(zhuǎn)速對固定化菌株降解油脂廢水的影響 搖床轉(zhuǎn)速的大小影響水相的溶解氧濃度，影響水相的傳質(zhì)系數(shù)，還關(guān)系到細(xì)胞是否破碎、固定化顆粒是否粉化等，從而影響處理效果。實(shí)驗(yàn)中，將等量固定化和游離菌株分別處理油濃度為2000mg/L、5000 mg/L的1

17、50mL色拉油廢水50h，溫度為30，pH6，改變搖床轉(zhuǎn)速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4 搖床轉(zhuǎn)速對固定化解脂耶氏酵母降解含油廢水的影響Fig.4 The effect of rotary velocity on degradation of immobilized Yarrowia lipolytica 圖4表明：隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，固定化和游離解脂耶氏酵母對色拉油的降解率均有提高，但搖床轉(zhuǎn)速對游離菌降解色拉油的效率影響明顯大于其對固定化微生物處理色拉油的效率影響。實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速從50r/min提高至200r/min時(shí)，游離細(xì)胞對色拉油的降解率從27.47%上升到 76.45%；而固定化微生物對

18、色拉油的降解率從44.67% 變化為52.38%。說明提高搖床轉(zhuǎn)速有利于提高降解率，但隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，被固定化和游離細(xì)胞處理的廢水樣品均更加渾濁，可能的原因是劇烈震蕩時(shí)剪切力增大，游離細(xì)胞容易破碎，而固定化載體物質(zhì)更容易滲漏，表明高轉(zhuǎn)速易導(dǎo)致載體的使用壽命減短，因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中固定化和游離細(xì)胞處理色拉油廢水均在150r/min下進(jìn)行。2.5 油濃度對固定化菌株降解油脂廢水的影響 在最佳條件下，將接種量相等的固定化和游離細(xì)胞分別處理油濃度為1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L的色拉油廢水50 h，結(jié)果見圖5。圖5起始油濃度對固定化解脂耶氏

19、酵母降解含油廢水的影響Fig.5 The effect of oil concentration on degradation of immobilized Yarrowia lipolytica 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在上述5個(gè)初始底物濃度下，固定化和游離菌對色拉油的降解趨勢相同，都是隨著油濃度的提高菌體細(xì)胞對色拉油的降解率降低。但在各個(gè)油濃度下，固定化微生物對色拉油的降解效率明顯低于游離細(xì)胞的降解率，當(dāng)油濃度為1000mg/L時(shí)，固定化微生物對色拉油的降解率最大為70%左右，而游離菌在油濃度為5000mg/L時(shí)對色拉油的降解率仍保持了70%。尤其是當(dāng)油濃度從2000mg/L變化為3000mg/L時(shí)

20、，固定化微生物對色拉油的降解率從66%下降至32%，此后降解率維持在30%左右一直到油濃度增加至5000mg/L，實(shí)驗(yàn)提示固定化解脂耶氏酵母不適宜高濃度油脂廢水的降解，顯示需進(jìn)一步摸索實(shí)驗(yàn)條件來提高固定化微生物對色拉油的降解效率。圖5表明：當(dāng)油濃度為2000mg/L時(shí)，固定化和游離細(xì)胞均對色拉油具有較高的降解率，所以我們將廢水濃度配制成2000mg/L來進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。2.6 包埋菌量對固定化菌株降解油脂廢水的影響 在最佳處理?xiàng)l件下，分別將菌濃度平均值為6.65106個(gè)/mL的解脂耶氏酵母 2、4、6、8、10、12mL包埋制備成固定化微生物，處理2000mg/L的150mL色拉油廢水50h，

21、結(jié)果見圖6。 實(shí)驗(yàn)表明：隨著包埋量的增加，固定化解脂耶氏酵母降解色拉油廢水的效率增加。當(dāng)包埋量4mL時(shí)，固定化微生物對色拉油的降解率隨著包埋量的增加呈直線上升，隨后當(dāng)包埋量進(jìn)一步增加時(shí)，固定化微生物對色拉油的降解效率略有增加但不明顯，包埋量從4mL增加到12mL時(shí)，固定化微生物對色拉油的降解率僅增加8%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與接種量對游離細(xì)胞處理色拉油廢水影響效果相一致2。揭示固定化菌株的最佳包埋菌量為4mL/150mL（即2.5%）,增加投菌量不能夠顯著增加固定化微生物降解色拉油廢水的效率。圖6接種量對固定化解脂耶氏酵母降解含油廢水的影響Fig.6 The effect of quantity ce

22、lls on degradation of immobilized Yarrowia lipolytica2.7 菌種馴化對底物降解的影響 為進(jìn)一步增加固定化微生物對色拉油廢水的處理效率，本研究室將包埋好的解脂耶氏酵母培養(yǎng)在YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度30、轉(zhuǎn)速160r/min搖床上培養(yǎng)30h進(jìn)行馴化，將馴化后的固定化微生物處理油濃度為2000mg/L的色拉油廢水，處理?xiàng)l件同上。結(jié)果見圖7。圖7 菌種馴化對底物降解的影響Fig.7 The effect of acclimation on the degradation實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：將馴化、未馴化固定化微生物和菌懸液分別處理油脂廢水時(shí)，三者都隨著

23、處理時(shí)間的延長，對色拉油廢水的降解率增加。尤其在處理前期20h，馴化固定化微生物對色拉油廢水的降解率比游離細(xì)胞的降解率高10%，比未馴化固定化微生物的降解率高20%左右，降解效率明顯高于游離細(xì)胞和未馴化固定化菌，實(shí)驗(yàn)提示：細(xì)胞被包埋后有一個(gè)逐漸適應(yīng)包埋載體新環(huán)境的過程，細(xì)胞馴化使得解脂耶氏酵母對海藻酸鈣的耐受性增強(qiáng)，從而提高的細(xì)胞本身的生物活性。處理50h時(shí)經(jīng)馴化的固定化微生物對色拉油的降解率達(dá)到82%，降解率仍比未馴化細(xì)胞高20%，但比游離細(xì)胞降解率低10%左右，可能的原因是細(xì)胞被包埋后，由于載體導(dǎo)致的傳質(zhì)阻力，使得細(xì)胞產(chǎn)生的解脂酶不能很好地與底物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞不能夠很好地利用底物。由于馴化后的固定化微生物在機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性和重復(fù)使用性等方