肝豆?fàn)詈俗冃哉n題匯報.ppt

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝豆?fàn)詈俗冃?肝纖維化治療的臨床研究 腦科醫(yī)院 肝豆?fàn)詈俗冃圆^(qū) 張東鋒,主要研究開發(fā)內(nèi)容,本研究采用分組對照臨床試驗(yàn)方法，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD肝纖維化的安全性和有效性進(jìn)行評價 檢測多種肝纖維化指標(biāo)及肝組織形態(tài)學(xué)病理改變；以觀察自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對肝纖維化病理進(jìn)程的影響 為開展間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD肝纖維化提供試驗(yàn)依據(jù),申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),概述 肝豆?fàn)詈俗冃裕℉epatolenticular degeneration，HLD） 又稱Wilson?。╓ilson disease，WD），是一種難治性的 常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病 由于銅在肝、腦等組織中異常

2、沉積引起相應(yīng)器官組織損 傷，臨床以肝硬化、腦損害等相關(guān)癥狀為主要表現(xiàn) 臨床癥狀復(fù)雜多樣，但所有患者由于銅離子自膽道排泄障 礙，造成游離銅在肝組織長期緩慢蓄積導(dǎo)致不同程度的肝 臟慢性損害，肝纖維化幾乎是每一個HLD患者肝臟的主要 病理改變,HLD流行病學(xué)調(diào)查 本病是較為常見的單基因遺傳病，國外Ferenci P等流行病學(xué)調(diào)查，本病發(fā)病率為1/3萬人，患病率為1525/10萬人，雜合子為1/100人 國內(nèi)劉焯霖等對19821991年神經(jīng)遺傳性疾病?？崎T診統(tǒng)計分析，結(jié)果HLD占10.14，居全部單基因遺傳病的第二位 我院統(tǒng)計2010年7月2011年2月期間427例住院患者，約70%的患者在院外由于誤

3、診誤治導(dǎo)致病情加重，甚至因?yàn)楦斡不Т鷥敾?及嚴(yán)重腦損害導(dǎo)致殘疾和死亡,申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),Ferenci P等,胡紀(jì)源等,楊任民等,HLD的病理研究 證實(shí)患者均存在 明顯的肝臟損害,絕大多數(shù)HLD患 者存在著不同程 度的肝纖維化聲 像學(xué)改變,HLD的肝纖維化 是患者最常見的 病理改變,其終末期病理,肝硬化失代償 是本病患者致 殘、致死的最 主要原因,我們認(rèn)為非常有必要 對HLD的肝纖維化進(jìn) 行系統(tǒng)研究,研究證實(shí)HLD患者均存在明顯的肝臟損害,干預(yù),申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),肝纖維化的病理機(jī)制,肝纖維化 的形成涉 及致病機(jī) 體反應(yīng)的 多個方面,反應(yīng)細(xì)胞,細(xì)胞因子,細(xì)胞

4、過量表達(dá)產(chǎn)物以及 降解酶等,復(fù)雜 的細(xì) 胞及 分子 機(jī)制,ECM 合成 增加,ECM 降解 減少,致病因子使 肝組織中,竇內(nèi) 皮細(xì) 胞,肝細(xì) 胞等,形成復(fù) 雜的細(xì) 胞-細(xì) 胞因子 網(wǎng)絡(luò),肝星 狀細(xì) 胞激 活,釋放多種因子,這些物質(zhì)常 被用作檢測肝纖 維化水平的血清 標(biāo)志物,HA LN PC- IV-C,ECM可 被基質(zhì)金 屬蛋白酶 （MMPs） 降解,基質(zhì)金屬 蛋白酶抑 制劑(TIMPs),結(jié)合,活性被抑制,阻止肝 臟ECM 的降解,ECM在肝臟沉積,肝纖維化,呂有魁等臨床觀察到多數(shù)HLD患者上述指標(biāo)明顯升高,劉焯霖等 觀察到兒 童HLD肝 組織內(nèi) TIMP-1、 TIMP-2表 達(dá)量增強(qiáng),國

5、內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)在治療HLD肝纖維化現(xiàn)狀 國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)在治療HLD肝纖維化尚屬空白，已報導(dǎo)的藥物尚無一種被正式批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床抗肝纖維化，這是因?yàn)?申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),某些藥物雖具 有抗肝纖維化 作用，但其靶 向性不強(qiáng)，對 其它組織也有 影響，長期應(yīng) 用副作用大,許多藥物早 期或短期有 預(yù)防作用， 對已形成的 肝纖維化療 效并不明顯,某些藥物在 某一環(huán)節(jié)有 抗肝纖維化 效果，但在 其它環(huán)節(jié)又 促進(jìn)纖維化 矛盾的作用,尋找有效治療HLD肝纖維化的途徑任重而道遠(yuǎn)卻又迫在眉睫,干細(xì)胞干預(yù)肝纖維化的研究現(xiàn)狀,申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),Peresen 等,Higashiyama R等,Sakaida等,A

6、ziz等,骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞及肝 星狀細(xì)胞， 可誘導(dǎo)活化 的肝星狀細(xì) 胞凋亡，明 顯減少膠原 沉積,骨髓干細(xì)胞定 植于肝臟，一 部分表達(dá)基質(zhì) 金屬蛋白酶， 促進(jìn)纖維條索 的溶解而發(fā)揮 抗纖維作用,骨髓干細(xì)胞移 至肝臟纖維條 索周圍 分泌 MMP-2、9 14增多 細(xì)胞 外基質(zhì)及膠原 條索降解增多 有利肝功改善,通過將MSCs 由尾靜脈注入 肝纖維化模型 鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)MSCs 具有向肝細(xì)胞 方向的轉(zhuǎn)化及減 輕肝纖維化的 功能,MSCs移植具有抗肝纖維化作用,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝損害的優(yōu)勢 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，來源豐富 分化能力強(qiáng) 免疫原性低 沒有倫理學(xué)障礙，不受道德及法律方面的限制 具有跨胚

7、層向多組織細(xì)胞分化的潛能和自我更新的高增值能力。,申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),本課題意義 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝豆?fàn)詈俗冃詫?dǎo)致的肝纖維化的安全性和有效性還需進(jìn)一步的評估 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療該病肝纖維化的機(jī)制也具有重要的意義,申請項(xiàng)目的必要性和依據(jù),實(shí)施方案 采用臨床試驗(yàn)方法，將病人分為三組: 青霉胺組 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)組; 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)加青霉胺組。 隨訪1-2年；治療后3、6、9、12個月觀察患者日常生活能力評價、臨床分級評價、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量變化、治療1年后肝組織活檢進(jìn)行病理檢查，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS處理。,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,給藥方案 青霉胺組

8、：青霉胺(上海信誼制藥公司生產(chǎn))，劑量為每日40mg/kg，連續(xù)816周 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)：將3l06細(xì)胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液2ml+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體。每10天靜脈干細(xì)胞移植一次，三次為一個療程 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)加青霉胺組：將3l06細(xì)胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液2m+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體，每10天靜脈干細(xì)胞移植一次，三次為一個療程。另將青霉胺（劑量為每日40mg/kg），每日分3次口服，連續(xù)816周,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,標(biāo)本收集 分別于治療后3、6、9、12個月抽取病人外周血1.2ml，用于細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量檢測； 治療后1年進(jìn)

9、行肝臟組織病理檢查,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,觀察指標(biāo)與方法 取血1.2ml，血標(biāo)本經(jīng)低速冷凍離心(3000轉(zhuǎn)/分)10分鐘后取血清約0.5ml進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目檢測。如：血清生化、肝纖維化指標(biāo)及相關(guān)細(xì)胞因子檢測 血清銅藍(lán)蛋白采用免疫比濁法，ALT采用比色法，LN、HA采用放射免疫法(RIA)，PDGF、 TGF1、IL-10、TNF-、MMP-1及TIMP-1采用ELISA法 肝臟組織病理檢查:肝臟標(biāo)本均作連續(xù)切片，每份標(biāo)本均行下述檢查：普通HE染色、膠原纖維采用Masson氏染色、網(wǎng)狀纖維采用Gomori染色 肝臟組織銅含量測定采用原子吸收分光光度法檢測,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS

10、處理，各組間比較采用one way ANOVA 分析,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,關(guān)鍵技術(shù) 肝臟穿刺可能會給病人帶來一定的痛苦和創(chuàng)傷，我們將請有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生在彩超監(jiān)測下進(jìn)行活檢 建立一套穩(wěn)定的檢測細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量方法直關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室檢測基質(zhì)金屬蛋白酶時，出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對于這一問題，我們正請有關(guān)專家?guī)椭⒎€(wěn)定、可靠的方法,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,技術(shù)路線,項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處 首次應(yīng)用人骨髓干細(xì)胞移植干預(yù)HLD患者，為開展骨髓干細(xì)胞移植治療HLD肝纖維化提供新的 理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù),項(xiàng)目研究開發(fā)內(nèi)容,已具備的試驗(yàn)手段 南方醫(yī)科大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院2008年成立了院士工

11、作站，并開展了干細(xì)胞治療。與此相適應(yīng)的投入一千萬元建立了一個現(xiàn)代化試驗(yàn)室，配備了先進(jìn)的試驗(yàn)設(shè)備。有能力提供高質(zhì)量、高活性的細(xì)胞 該研究與我們剛獲得的國家自然基金項(xiàng)目可以共享試驗(yàn)設(shè)備和人力資源，我們又投入500多萬元，購買了與試驗(yàn)相關(guān)的設(shè)備， 如ABI3730XL序列儀、高速冷凍離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、PCR儀、分子生物學(xué)平臺、高速離心機(jī)、懸渦振蕩器，磁力攪拌器，PH計，立式高壓消毒鍋，微波爐等 院士工作站具備完成本課題所需的條件,實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件,已具備的技術(shù)力量,實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件,項(xiàng)目的預(yù)期經(jīng)濟(jì)、社會和環(huán)境效益,通過以下三方面的研究 評價骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療HLD患者的安全性和有效性（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能） 探討經(jīng)人靜脈骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)肝纖維化的病理過程 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對多種肝纖維化指標(biāo)、細(xì)胞