PCB技術(shù)簡(jiǎn)介(要素、歷史、影響因素、應(yīng)用以及污染和預(yù)防)（全面）

1、何謂PCR 簡(jiǎn)單的說,PCR就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)(InVitro)的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制.目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。 PCR的要素 基本的PCR須具備.要被復(fù)制的DNA模板(Template).界定復(fù)制范圍兩端的引物(Primers).DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水。PCR反應(yīng)包括三個(gè)主要步驟,分別是 1).Denaturation2).Annealingofprimers,and3).Extensionofprimers。所謂Denaturing乃是將DNA加熱變性,

2、將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板.而Annealing則是令Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下進(jìn)行引物的延長(zhǎng)(Extensionofprimers)及另一股的合成。PCR的歷史 PCR的發(fā)展可以說是從DNA合成酵素的發(fā)現(xiàn)緣起。DNA合成酵素最早于1955年發(fā)現(xiàn)(DNApolymeraseI),而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及可得性的 KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn),但由于這個(gè)酵素是一種易被熱所破壞之酵素,因此不符合一連串的高溫連鎖反應(yīng)所需?，F(xiàn)今所

3、使用的酵素(簡(jiǎn)稱Taqpolymerase),則是于1976年從熱泉Hotspring中的細(xì)菌(ThermusAquaticus)分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫,是一個(gè)很理想的酵素,但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制(DNArepairreplication),它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制(類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng))的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的,Dr.Mullis當(dāng)年服務(wù)于一家物科技研究公司(Perkin- ElmerCetusCorporat

4、ion).目前這家公司在PCR的相關(guān)儀器及原料上占有很大的巿場(chǎng)。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。此后,PCR的運(yùn)用一日千里,相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。在1989年,Science將PCR中的DNA合成酵素命名為當(dāng)年的風(fēng)云分子(Moleculeoftheyear),而PCR本身則列為年度的重要科學(xué)發(fā)明產(chǎn)物。當(dāng)然,它的原發(fā)明者更在往后獲得諾貝爾的桂冠。 影響PCR的因素 PCR是非常直接、簡(jiǎn)單又具有強(qiáng)大威力的技術(shù)。誠(chéng)如一位當(dāng)年參與PCR誕生的資深研究員HenryErlich所言”在分子生物學(xué)的領(lǐng)域中,只要擁有它,你便可以無(wú)照營(yíng)

5、業(yè)” (PCRallowspeopletopracticemolecularbiologywithoutaliscence)。也因此,活用及慎用PCR是確保一定品質(zhì)的必要條件。PCR本身雖然是一個(gè)單純的實(shí)驗(yàn)技術(shù),但是一個(gè)好的PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物則是受到很多因素的影響。這些因素色括反應(yīng)中各種原料的濃度(Taq.Polymerase,primers,dNTPs,MgCl2),也包括整個(gè)反應(yīng)中各步驟的溫度與時(shí)間的設(shè)定。當(dāng)然DNA模板(Template)與引信(Primers)本身?xiàng)l件也占有一定的重要性。近來(lái)的觀念中,共溶劑諸如Dimethylsulfoxide(DSMO)、glycerol、 Fora

6、mideandTetramethylammoniumchloride(TMAC)也對(duì)整個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生若干重要的影響。 PCR的運(yùn)用 PCR除了是一個(gè)診斷工具外,更重要的是它有廣泛的運(yùn)用。PCR本身可直接用來(lái)鑒定特定基因的存在與否,也可以用來(lái)偵測(cè)基因是否有異常(Genemutation,deletion,andrearrangement)。例如,在醫(yī)學(xué)上對(duì)遺傳疾病或腫瘤癌癥的診斷及預(yù)后的評(píng)估；對(duì)細(xì)菌、病毒及霉菌感染的診斷。它也可成為一個(gè)生產(chǎn)線進(jìn)而大量復(fù)制特定的基因進(jìn)行基因密碼的讀取(DNAsequencing)及其它的運(yùn)用。舉凡對(duì)生物標(biāo)本及法醫(yī)學(xué)上的樣本鑒定,從單一毛發(fā)、一只精蟲或一滴血液、唾液來(lái)找

7、出兇手。也可以做DNA指紋(Fingerprints)比對(duì)幫助親子關(guān)系的鑒定。PCR更可以用于器官移植組織兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析,經(jīng)由PCR的運(yùn)用也產(chǎn)生重大的進(jìn)展。近來(lái),在生物醫(yī)學(xué)的研究上,特別是細(xì)胞間訊息的傳遞分子,諸如介白質(zhì)(Interleukines)及各種生長(zhǎng)因子(Growthfactors)基因的表現(xiàn)都可用 PCR來(lái)進(jìn)行質(zhì)與量的分析。 PCR污染及解決對(duì)策PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí),一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。 一污染的預(yù)防 進(jìn)行PCR操作時(shí),操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。 (一)劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不

8、能做到單人單管,實(shí)現(xiàn)完全閉管操作,但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行: 1.標(biāo)本處理區(qū),包括擴(kuò)增摸板的制備； 2.PCR擴(kuò)增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增； 3.產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。 各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材專用,要有一定的方向性。如:標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。 切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。(二)分裝試劑:PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他

9、來(lái)源的DNA: 1PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水； 2引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制； 3引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存,分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間,以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。 (三)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意: 1.戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套； 2.使用一次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染； 3.避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若

10、不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4.操作多份樣品時(shí),制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度； 5.最后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管； 6.操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8.重復(fù)實(shí)驗(yàn),

11、驗(yàn)證結(jié)果,慎下結(jié)論。 二追蹤污染源 如果不慎發(fā)生污染情況,應(yīng)從下面幾條出發(fā),逐一分析,排除污染。 (一)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照:有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí),應(yīng)選擇擴(kuò)增弱,且重復(fù)性好的樣品,因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列,反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照,100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重,因?yàn)镻CR敏感性極高,可以從其它方法(Sourthern印跡或點(diǎn)雜交等)檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外,每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照,即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分,而不加模板DNA,這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PC

12、R產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果,就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí),要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管,每一管含有一種被檢測(cè)試劑,在檢出污染試劑后,應(yīng)馬上處理。 (二)環(huán)境污染:在排除試劑污染的可能性外,更換試劑后,若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了,如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密,則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源主要有: 1.模板提取時(shí)真空抽干裝置； 2.凝膠電泳加樣器； 3.電泳裝置； 4.紫外分析儀； 5.切膠用刀或手術(shù)刀片； 6.離心機(jī)； 7.冰箱門把手,冷凍架,門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等； 此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源。1)用無(wú)菌水浸泡過的滅菌

13、棉簽擦拭可疑污染源；2)0.1ml去離子水浸泡；3)取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4)電泳檢測(cè)結(jié)果。 8.氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn),仍不能查找到確切污染源,則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的,此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所,若條件不允許,則重新設(shè)計(jì)新的引物(與原引物無(wú)相關(guān)性)。 三污染處理 (一)環(huán)境污染 1.稀酸處理法:對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡,使殘余DNA脫嘌呤； 2.紫外照射(UV)法:紫外波長(zhǎng)(nm)一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí),要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布,UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)

14、片段有效,對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí),PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體,這些二聚體可使延伸終止,但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng),嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上,形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基,其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體,胸腺嘧啶乙二醇,DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和 DNA斷裂等)均可終止TaqDNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)(0.13/堿基)在DNA分子上隨機(jī)分布,一個(gè) 500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn),那么,

15、105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反,如果100bp的片段,每條鏈上僅有 6處損傷,105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。(二)反應(yīng)液污染 可采用下列方法之一處理: 1.DNaseI法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5UDNaseI,室溫反應(yīng)30min后加熱滅活,然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列； 2.內(nèi)切酶法:選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶(如MspI和TaqI等),可同時(shí)選擇幾種,以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷,室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR； 3.紫外照

16、射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射,注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法； 4.g射線輻射法:1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子,4.0kGy仍不影響PCR,但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來(lái)破壞DNA的。(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法 由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好,而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為 300bp左右,因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。 1.原理:在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與 UN

17、G一起孵育,因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵,可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無(wú)任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶,而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無(wú)任何作用。 2.dUTP法:用 dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前,用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活,因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。 3.dU引物法:合成引物時(shí)以dU代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5端帶 dU。UNG處理后,引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)

18、片段(1-2kb以上)的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低,而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。 dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3端或近端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。 4.優(yōu)點(diǎn):可以去除任何來(lái)源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在,可徹底消除污染源。 5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響,在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí),應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-(UNG缺陷)大腸桿菌受體菌,否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。 (四)固相捕獲法 用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì),原理如下:1)用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交,雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2)用包

19、被鏈霉親和素的固相載體來(lái)捕獲帶有生物素探針的雜交核酸,通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3)洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第2)步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。 (五)RS-PCR法(RNA-specificPCR) 也稱為鏈特異性PCR,主要指用于 RNA模板的特異性PCR法,該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物,逆轉(zhuǎn)錄引物的3端(A區(qū))有20個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列,5端20個(gè)核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后,經(jīng)超速離心使cDNA與多余引物分開,再用和第二引物(C)以第一鏈cDNA為模板

20、合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。 (六)抗污染引物法 該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中,在重組質(zhì)粒中,這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本,也不能擴(kuò)增出任何條帶,即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶,其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增,因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽(yáng)性的,該法試用于環(huán)狀靶分子系列。 四其它PCR檢測(cè)方法: (一)兩步法:是指在用套式 PCR方法擴(kuò)增某些含量低微的標(biāo)本時(shí),兩對(duì)引物在同一個(gè)管中以簡(jiǎn)化步驟,減少污染

21、。通常第一步進(jìn)行20205個(gè)循環(huán),擴(kuò)增外引物片段；第二步再進(jìn)行10個(gè)循環(huán),擴(kuò)增內(nèi)引物片段。兩步法對(duì)內(nèi)外引物的Tm值有特殊要求,即內(nèi)外引物的退火溫度高(如68),在此溫度下內(nèi)引物不與模板退火,然后降低退火溫度(至 55)再擴(kuò)增內(nèi)引物片段,這樣,在操作過程中,僅打開PCR反應(yīng)管一次,大大減少了污染的可能性。(二)熒光法:亦稱熒光PCR技術(shù)(fluoresencePCR,F-PCR),是1995年由美國(guó)PE公司首先研制成功的,它融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn),電腦同步跟蹤,數(shù)據(jù)自動(dòng)化處理,直接探測(cè)PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果,不需要做 PCR后處理或檢測(cè),完全閉管操作。探針標(biāo)記除用TET和FAM外,還可用HEX、JOE作為報(bào)告熒光,3端的淬滅基團(tuán)常用TAMRA。在探針保持完整時(shí),熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光被熒光抑制基團(tuán)淬滅,而在探針被切斷后,熒光報(bào)告基團(tuán)才發(fā)出報(bào)告熒光,且熒光的強(qiáng)度與PCR