葉綠素含量的測(cè)定;

1、葉綠素含量的測(cè)定1、 原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度a與其中溶質(zhì)濃度c和液層厚度l成正比，即acl式中：比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三

2、個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度a，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。 已知葉綠素a、葉綠素b的80%丙酮溶液在紅外區(qū)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。已知在波長(zhǎng)663nm下葉綠素a、葉綠素b在該溶液中的吸光系數(shù)的分別為82.04和9.27；在波長(zhǎng)645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： a663=82.04ca+9.27cb （1） a645=16.76ca+45.60cb （2） 式（1） （2）a663nm和a645nm為葉綠

3、素溶液在663nm和645nm處的吸光度，ca cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度，以mg/l為單位。 解方程（1） （2）組得 ca=12.72 a6632.59 a645 (3) cb=22.88 a6454.67 a663 (4) 將ca+cb相加即得葉綠素總量ct ct ca十cb20.29a6458.05 a663 (5) 從公式（3）、（4）、（5）可以看出，就可計(jì)算出提取液中的葉綠素a、b濃度另外，由于葉綠素a 葉綠素b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)（均為30.5），也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度（a652）而求出葉綠素a、葉綠素 b 總量 所測(cè)定材料的單位面積或

4、單位重量的葉綠素含量可按下式進(jìn)行計(jì)算： ct (6) 有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)出溶液中類(lèi)胡蘿卜素的含量。licht-enthaler等對(duì)arnon進(jìn)行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3種色素含量的計(jì)算公式： ca12.21a6632.59 a646 (7) cb=20.13 a6465.03a663 (8) cx.c (9) 式中：ca cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度； cx.c為類(lèi)胡蘿卜素的總濃度；a663 a646 a470 分別為葉綠素提取液在波長(zhǎng)663nm 646nm 470nm下的吸光度。由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，

5、計(jì)算公式也有所不同。綠素a 、葉綠素b在95%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm,類(lèi)胡蘿卜素為470nm,可據(jù)此列出以下關(guān)系式； ca13.95a6656.8a649 (10) cb=24.96 a6497.32a665 (11) cx.c (12)2、 材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料 新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設(shè)備 1. 分光光度計(jì)；2. 電子頂載天平（感量0.01g）；3. 研缽；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量濾紙；7. 吸水紙；8. 擦境紙；9. 滴管。（三）試劑1.96乙醇（或80丙酮）。2.石英砂。3.碳酸鈣粉。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取新鮮植物葉片（

6、或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2. 稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml95乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、64

7、9nm下測(cè)定吸光度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算與分析按公式 (10) 、 (11) 、 (12) （如用80%丙酮，按公式7、8、9）分別計(jì)算綠素a 、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的濃度（mg/l）。(10) 、 (11)式相加即得葉綠素總濃度。求得色素的濃度后再按下式計(jì)算組織中個(gè)色素的含量（mg/l鮮質(zhì)量或干質(zhì)量表示）：葉綠素含量（mg/g）=式中：c為色素含量(mg/l);v為提取液體積 (ml)；n為稀釋倍數(shù)；w為樣品鮮質(zhì)量或干質(zhì)量(g)；1000即1l=1000ml。注意事項(xiàng)(1) 為了避免葉綠素光解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，淹沒(méi)時(shí)間應(yīng)盡量短些。(2) 葉綠體色素提取液不能 渾濁。可在710nm或750nm下測(cè)量吸光度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長(zhǎng)為葉綠素a吸收峰時(shí)吸光之哦的5%，否則應(yīng)重新過(guò)濾。(3) 用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量，對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)精確度要求較高。如果波長(zhǎng)與原吸收峰波長(zhǎng)相差1nm,則葉綠素a的測(cè)定誤差為2%，葉綠素b為19%，使用前必須對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說(shuō)明書(shū)外，還應(yīng)以純的葉綠