檢驗分子水平自然選擇的方法

1、檢驗分子水平自然選擇的方法在選擇主義與中性主義的爭論中，中性理論提出了很多的假設，其中的許多涉及到群體內(nèi)等位基因頻率分布，以及種內(nèi)-種間遺傳變異的關系。因此，可以利用統(tǒng)計學模型來驗證中性學說的正確性，即把中性理論作為統(tǒng)計學檢驗的零假設（null hypothesis），非中性選擇作為選擇性假設（alternative hypothesis），如果這個零假設被顯著地拒絕（significantly rejected），那么中性假設將被認為是不合適的（Kimura and Ohta 1971）。關于在分子水平驗證選擇的方法，Garrigan和Hedrick（2003）認為可以按照種群的當前世代，種

2、群的短期歷史和物種的長期演化歷史三種時間尺度來劃分為三類。然而，選擇是一個長期作用的過程，種群的當前世代體現(xiàn)出來的臨時狀態(tài)無法真實反映選擇的作用；并且這種時間尺度的劃分也不利于尋找種內(nèi)-種間遺傳變異所反映的選擇信號。Nielsen（2005）則把選擇檢驗分為群體遺傳學檢驗（population genetic approaches）和比較數(shù)據(jù)檢驗（comparative data approaches）。Biswas和Akey（2006）從基因組學的角度出發(fā)，將選擇檢驗的方法分為種內(nèi)多態(tài)性，種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧，和種間檢驗三類。事實上，不論如何劃分，不同的檢驗方法都有不同的數(shù)據(jù)類型作為檢驗對象

3、。因此，在這篇綜述里我將按照數(shù)據(jù)類型的不同對目前常用的統(tǒng)計檢驗方法進行整理和歸納。（1）基于群體內(nèi)等位基因頻率分布的中性檢驗在核酸的堿基測序時代之前，群體遺傳多樣性的研究手段主要是對遺傳標記的電泳圖譜進行分析，其中等位基因的雜合度（allele heterozygosity）曾經(jīng)是一個普遍用于描述遺傳多樣性的指標。以某單一等位基因位點為例，在一個個體數(shù)為1000的群體里，如果其中50個個體在該位點是雜合子，那么我們可以簡單地把（Ho）=50/1000=0.05作為該位點的表觀雜合度；說明該種群在以這個位點為遺傳標記時得到的遺傳多樣性程度不高，即仍有95%的個體是純合子。這種評估方式適用于小片段

4、的蛋白質(zhì)或核酸序列（如幾十或者幾百個氨基酸或堿基），但不適用于較長片段的研究。事實上，在自然狀態(tài)下，核酸水平上的變異是比較豐富的，尤其從大片段的尺度來看。例如比較兩條長度為10,000 bp的等位基因，如此長度的序列幾乎可以肯定他們是雜合的，因為序列越長，里面的變異越豐富，那么可以想象該位點在群體里雜合度Ho接近1。因此，在對核酸序列進行群體遺傳多樣性分析時，考慮兩條序列間存在多少差異所獲得的遺傳多樣性信息要遠遠大于判斷他們是純合子還是雜合子（Li 1997）。在后來發(fā)展起來的群體遺傳學研究中，有三個重要指標被運用于評估核酸遺傳多樣性（Nei 1987; Li 1997）。第一個是，即將所研究

5、群體的所有核酸序列中任意兩條不同序列的堿基差異數(shù)取平均值；這個指標對等位基因頻率依賴很大。第二個是K，即分離位點數(shù)（number of segregating sites），現(xiàn)在也被稱為SNP（single nucleotide polymorphism），是指所有序列排列比對后存在變異的堿基位點數(shù)目；這個指標依賴于等位基因數(shù)目而與等位基因頻率無關。第三個是Na，即等位基因數(shù)（number of alleles）。此外，有一個非常關鍵的反映種群動態(tài)的參數(shù)將以上三個指標在數(shù)學上聯(lián)系起來；這里=4Ne，其中Ne為有效種群大小，為每一代的序列突變率（Watterson 1975; Tajima 19

6、83）。有兩種公認的估值，一個是Watterson估值（Wattersons estimator, W），把與K聯(lián)系起來，即W=K/a，其中a=1+1/2+1/3+ ? +1/(n1)（Watterson 1975）；另一個是Tajima估值（Tajimas estimator, T），即T=（Tajima 1983）。從理論上說，在中性條件下，應當有T=W=4Ne的平衡狀態(tài)。因此，Tajima（1989）設計了D值檢驗（Tajimas D），即D=(TW)/Var(TW)，通過統(tǒng)計學模型來驗證中性突變假說。Tajimas D值檢驗的作用原理是（Tajima 1989）：在原有的平衡狀態(tài)中（T

7、=W=4Ne），所以D=0。但是，如果群體中存在許多低頻率的等位基因（稀有等位基因），可以期望K/a不斷增大而并未受到嚴重影響，因為后者主要是由高頻率等位基因決定的。于是有TW，則DW，D0。Tajima（1989） 把過多低頻率等位基因的存在歸咎為定向選擇時，選擇性清除下選擇性清除會削弱原有等位基因的在群體中的頻率，而使新等位基因以低頻率補充進來成為稀有等位 基因。相反，如果是中等頻率的等位基因占主導，則可能是平衡選擇的結(jié)果，或者是種群大小在經(jīng)歷瓶頸時使稀有等位基因丟失。因此，當Tajimas D顯著大于0時，可用于推斷瓶頸效應和平衡選擇；當Tajimas D顯著小于0時，可用于推斷群體規(guī)模

8、放大和定向選擇。由于平衡選擇與定向選擇都屬于正選擇的范疇，因此，只要D值顯著背離0，就可能是自然選擇的結(jié)果；而當D值不顯著背離0時，則中性零假說則不能被排除。之后，F(xiàn)u和Li（1993）提出了與Tajimas D略為不同的方法來檢驗中性進化，即Fu and Lis D & F test。他們考慮的是可以獲得外類群的情況，因而對一組給定的等位基因序列可以構建一顆有根樹。在這棵樹上，總突變數(shù)為y，內(nèi)部分枝突變數(shù)為yi，外部分枝的突變數(shù)目為ye，則y=yi+ye。這里y和ye的數(shù)學期望值分別為E(y)=a*，E(ye)= ，其中a=1+1/2+1/3+ ? +1/(n1)。如果發(fā)生了選擇作用，那么外

9、部分枝突變數(shù)將會偏離期望值，而內(nèi)部分枝突變數(shù)并未受到嚴重影響。因此，可根據(jù)與Tajimas D類似的策略，構建統(tǒng)計模型來驗證中性零假說。此外，F(xiàn)ay和Wu（2000）構建了H檢驗（Fay and Wus H test），用以測試高頻率變異與中等頻率變異的差異。他們認為在中性占主流的狀態(tài)下，并不期望會出現(xiàn)很多高頻率的變異，因而僅僅根據(jù)少數(shù)存在的高頻率的變異就可以推斷“搭車效應”。在果蠅的一些低頻重組的區(qū)域中，H檢驗觀察到了許多高頻率變異，因此，F(xiàn)ay和Wu（2000）推斷果蠅中的這些高頻變異可能是由于“搭車效應”時正選擇保留了有利變異并使其以高頻率在群體中存在。到目前為止，Tajimas D，F(xiàn)

10、u and Lis D & F test和Fay and Wus H test，可能是針對群體內(nèi)的等位基因頻率被運用得最廣泛的中性檢驗模型（Nielsen 2005）。（2）基于連鎖不平衡的中性檢驗這里面首先涉及的參數(shù)是等位基因頻率（allele frequency），基因型頻率（genotype frequency）和單倍型頻率（haplotype frequency）。在無視連鎖的情況下，最簡單的單一位點模型是“哈迪溫伯格平衡”（HardyWeinberg equilibrium）模式。假設在單一位點上有兩種等位基因A和a，那么該群體存在三種基因型：AA，Aa和aa。如果用p表示A的等位基

11、因頻率，q表示a的等位基因頻率，那么在經(jīng)典的Mendel的基因分離定律和獨立分配定律下，p2為AA的基因型頻率，2pq為Aa的基因型頻率，q2為aa的基因型頻率，則有p2+2pq + q2=1。哈迪溫伯格平衡模式認為（Hardy 1908; Weinberg 1908），對于一個理想群體，即無窮大的隨機交配且沒有任何進化壓力的群體，基因型頻率將以p2，2pq和q2的比例存在于隨機交配后的各代中，等位基因頻率不會逐代發(fā)生改變，故而這個基因座位的基因庫不會發(fā)生進化。事實上，當兩對性狀或者考慮兩個等位基因座位時，我們必須考慮有可能的連鎖和重組現(xiàn)象。假設研究對象為兩個基因座位A和B，每個座位上的等位基

12、因分別是A1和A2，B1和B2，那么用x來表示四種單倍型的頻率：A1B1：x11 A1B2：x12 A2B1：x21 A2B2：x22 而每一個等位基因的頻率表示為： A1： p1 = x11 + x12 A2 ：p2 = x21 + x22 B1： q1 = x11 + x21 B2： q2 = x12 + x22假設兩個座位上的等位基因是自由地獨立地分配到后代中去，那么以A1B1為例，我們可以期望x11 (e)= p1q1。這時單倍型頻率的觀察值x11 (o)與期望值x11 (e)之間的差異，就可以用來反映連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）：D= x11 (

13、o) p1q1。連鎖平衡（linkage equilibrium, LE）指的就是這種兩個座位上的等位基因是自由地獨立地分配到后代中去的現(xiàn)象，A與B的組合是完全隨機的，因此有D=0，即LD為零的狀態(tài)。我們其實可以把LE看作是雙位點版本的“哈迪溫伯格平衡”，只不過這里是單倍型頻率而不是基因型頻率。當D0時，觀察值與期望值不符，我們就說這兩個等位基因處于連鎖不平衡狀態(tài)。事實上，重組能打斷連鎖關系而使在很多代以后LD趨向于0。假設c（0c1）為兩位點間的充重組率，則在第二代時A1B1的單倍型頻率為：x11=(1c)x11+c p1q1，也可以寫成 x11p1q1=(1c) (x11p1q1)，即 D

14、1=(1c)D0。擴展到第n代時，有Dn=(1c)nD0。如果n趨向于+，則(1c)n趨向于0，這時Dn=0。如果兩位點在物理距離上越接近，連鎖越緊密，被重組的可能性就越低，則Dn0的速率就越慢。在前面提到的“搭車效應”中，當一個有利突變開始產(chǎn)生時，它是處于完全LD狀態(tài)的，即可視為與其構成單倍型的所有基因完全連鎖，而其他單倍型因為不存在這個突變而被選擇性清除所消滅（Ennis 2007）。因此，搭車效應，正選擇，選擇性清除，連鎖不平衡，基因重組以及群體結(jié)構相聯(lián)系組成了一種情況極為復雜的局面，使得基于LD檢驗統(tǒng)計模型的設計成為一個難度極高的挑戰(zhàn)。盡管如此，近幾年，已經(jīng)發(fā)展出了一些檢驗方法用于檢測

15、與LD相關聯(lián)的自然選擇，包括LRH test（Sabeti et al. 2002），iHS test （Voight et al. 2006），LDD test （Wang et al. 2006）等。然而，這些檢驗效力如何，還需要更多的研究結(jié)果來提供證據(jù)。（3）基于種群分化的檢驗Wright（1931）首先給出了群體遺傳分化系數(shù)Fst的計算公式，用以評估亞群體的分化程度。Cavalli-Sforza（1966）認為自然選擇可能會對群體亞分化形成貢獻，因此首次建議用群體間的分化程度來推斷自然選擇的作用。隨后，基于這一想法，大致有兩種類型的方法被用于自然選擇的測試。一種是Lewontin-Kr

16、akauer test（Lewontin and Krakauer 1973），其作用原理是：群體間的基因流（gene flow）會使大多數(shù)位點形成較為平均的遺傳分化程度，除了一些明顯的異常值（outliers）。大體上，這些異常值可以反映兩個方向上的選擇：適應性選擇能在某些位點上產(chǎn)生異常的高水平遺傳分化，而平衡選擇則有可能產(chǎn)生低于平均水平的遺傳分化。因此，從異常位點與正常位點的遺傳分化程度的比較可以推斷自然選擇。然而，最初的這種Lewontin-Krakauer test被Nei和Maruyama（1975）以及Robertson（1975）所批評，認為在許多群體模型中，該檢驗中Fst的期望

17、方差無效。盡管如此，這種思想近年來有逐漸抬頭的勢態(tài)，尤其在運用到基因組大尺度數(shù)據(jù)的時候。例如Akey等(2002)在基因組尺度對人類不同群體的Fst進行了測算推斷其中的選擇作用；Beaumont與他的同事（Beaumont and Nichols 1996; Beaumont and Balding 2004）則設計了更為復雜的統(tǒng)計學模型來檢測群體亞分化水平上的異?；蛭稽c。另一種方法是檢測不同位點在不同種群中的雜合度水平。例如Schlotterer等（1997）和Schlotterer（2002） 認為在不同種群中通過比較多位點的雜合度，可以把選擇的作用和種群統(tǒng)計學效應區(qū)分開來。兩個不同群體

18、大小的種群，小種群在基因組上的期望變異水平都應低于 大種群。但是受到選擇的單位點的變異程度則可能會比基因組水平的差異更低。因此，把群體結(jié)構與多個單位點變異聯(lián)合考慮，則可能推斷出基因組上的哪些區(qū)域有 可能受到了選擇。以上的基于種群分化的檢驗盡管還沒有得到非常普及地應用，但事實上，最近的一些研究表明（Nielsen 2005），“選擇性清除”會強烈地影響群體的亞分化水平，尤其是當“選擇性清除”沒有來得及涉及到所有研究群體的時候，這種作用更明顯。因此，基于群體分化程度來尋找自然選擇的信號，仍然是一種可行的思路。（4）基于種內(nèi)多態(tài)性和種間分歧度之間數(shù)據(jù)比較的檢驗中性理論預言，在中性狀態(tài)下，種內(nèi)多態(tài)性（

19、intraspecific polymorphism）與種間分歧度（interspecific divergence）之間呈正相關。基于這種預測，有兩種檢驗方法先后被提出，分別是HudsonKreitmanAguade (HKA) test和McDonald-Kreitman (MK) test。HKA檢驗認為（Hudson et al. 1987），在中性狀態(tài)下，對于不同的基因或者基因位點而言，即使他們之間的變異程度不同，但他們各自的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將是相同的。例如，組蛋白基因（histone） 是一個相當保守的基因，突變率很低，因此組蛋白基因種內(nèi)多態(tài)性程度很低，其種間變異度

20、也很低。而對于某些非編碼序列來說，其突變率很高，不論在種內(nèi)種間都 體現(xiàn)了很高的變異水平。但是，在中性條件下，不論對于組蛋白基因還是非編碼序列，他們的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將是相當?shù)摹Ｈ绻匀贿x擇發(fā)生了 作用，那么受選擇的基因，其種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將偏離中性狀態(tài)下的期望值。因此，通過同時比較兩個或者多個基因各自的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧 度之比，HKA檢驗可以檢測到自然選擇的作用。但是，HKA的一個很大的限制就是所研究的基因或者基因位點之間必須是相互獨立的，即不存在連鎖關系。因為一些研究發(fā)現(xiàn)，連鎖位點所受到的選擇作用，影響的是種內(nèi)多態(tài)性而不是種間的分歧度水平（Maynard-

21、Smith and Haigh 1974; Birky and Walsh 1988），因此，除了選擇作用之外，任何非中性的影響（如搭車效應或選擇性清除）都會使種內(nèi)多態(tài)性偏離期望值。也就是說，HKA所檢測到的自然選擇信號，有可能是所研究位點受到了選擇，也有可能是與其連鎖的位點受到了選擇而通過某些非中性效應使所研究位點多態(tài)性發(fā)生了變化，盡管所研究位點仍然是遵循中性進化的。 隨后發(fā)展起來的MK檢驗則避免了多基因或者多位點有可能存在的連鎖效應所帶來的假陽性信號。MK檢驗的基本原理是（McDonald and Kreitman 1991）：僅僅考查某一基因分別在種內(nèi)和種間的非同義（nonsynonym

22、ous）與同義突變（synonymous）的比值。具體而言，針對A與B這兩個近緣物種，我們把基因G在這兩個物種里能發(fā)現(xiàn)的所有等位基因進行匯總和排列比對后，關注其中存在變異的核苷酸替換位點而忽略無變異位點，即關注分離位點（segregating sites）或SNP（single nucleotide polymorphism）位點。在這些所有的變異位點中，假設某一位點如果在來自物種A的所有等位基因里都是堿基C，而在來自物種B的所有等位基因里都是堿基T，那么針對A與B這兩個近緣物種而言，這個變異位點我們定義為被固定的替換位點（fixed substitution site）；其余的變異位點稱為多態(tài)性位點（polymorphic site）。如果用Sf，Nf，Sp和