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文檔簡介

1、pcr反應原理及其操作,1.pcr的基本原理 2.pcr反應體系 3.pcr的基本步驟,pcr反應體系,4種dntp混合物 各200umol/l （datp,dgtp,dctp,dttp） 引物 各10100pmol 模板dna 0.12ug taq dna聚合酶 2.5u mg2+ 1.5mmol/l,pcr的基本步驟,1. dna變性 （90-96）：雙鏈dna模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈dna。2. 退火（復性）（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與dna模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3. 延伸（70-75）：在taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的5端3端

2、延伸，合成與模板互補的dna鏈。,低溫退火,中溫延伸,在引物作用下，taq酶從引物3端開始延伸dna鏈，即dna的合成方向是從子鏈的5端自3端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)dna的復制過程。dna的復制需要引物，其主要原因是dna聚合酶只能從3端延伸dna鏈。,pcr每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。dna模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、dna聚合酶催化新生dna的合成（延伸）三個步驟構(gòu)成pcr反應的一個循環(huán)。 此循環(huán)反復進行，可使目的dna得以迅速擴增。,理論擴增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），2530循環(huán)，目標dna可增加109倍。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式。 以

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