細胞凋亡檢測方法

1、細胞凋亡檢測方法一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測1光學顯微鏡和倒置顯微鏡 （1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細胞：姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。 蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯

2、微鏡 一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有： Hoechst33342， Hoechst33258，DAPI。三種染料與DNA 的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。 Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。PI和Hoechst33342雙標：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但PI不能通過正常細胞膜，Hoec

3、hst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態(tài)學改變分為三期：期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；a期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；b期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(

4、圖1)。3透射電子顯微鏡觀察 凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡期（pro-apoptosisnuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結構(圖2)；a期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。 二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜內側，但在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜內側翻轉到細胞膜表面，暴露在細胞外環(huán)境中。磷脂酰絲氨酸的轉位發(fā)生在凋亡早期階段，先于細胞核的改變、DNA斷裂、細胞膜起泡。體內的吞噬細胞可通過識別磷脂酰絲

5、氨酸來清除凋亡細胞。Annexin-V（green）是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合，細胞處于調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期壞死細胞可能為陰性），是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。PI和Annexin-V雙標：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Anne

6、xin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。*注意：細胞凋亡時其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時應該注意。 活細胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細胞膜，故呈Annexin V-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）。壞死或晚期凋亡的細胞呈Annexin V-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限）。*注意：未處理的對照細胞進行常規(guī)培養(yǎng)的過程中也有一小部分的

7、細胞死亡發(fā)生。三、線粒體膜電位的檢測線粒體跨膜電位下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。名稱檢測原理3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）一種有細胞通透性及電壓敏感性的親脂性陽離子熒光染料，用作膜電位探針，能選擇性地染線粒體及內質網(wǎng)3，3-Dihexyloxadicarbocyanine iodide一種有細胞通透性及電

8、壓敏感性的親脂性陽離子熒光染料，能識別發(fā)卡四重結構。也用作端粒酶抑制劑及抗癌試劑，能在活細胞特異地染色線粒體，用于線粒體定位及鑒定其氧化能力Rhodamine 123一種能染活細胞線粒體的有膜通透性的熒光染料，廣泛用于測定線粒體膜電位，能用于檢測耐藥的腫瘤細胞的P-糖蛋白的流出活性。JC-1一種陽離子染料，用作線粒體膜電位的指示劑注意事項1 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。2 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。四、DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的

9、連接處斷裂, 形成50300kbp長的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。1.大分子染色體DNA片段的測定 細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的

10、遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為爬行。因此，細胞凋亡早期產生的50300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。2.DNA La

11、dder 測定3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)優(yōu)點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。五 TUNEL法細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase m

12、ediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。 六、Caspase-3活性的檢測 Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的

13、許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚ADP-核糖聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。2 熒光分光光度計分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)

14、這一特點，設計出熒光物質偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。3 流式細胞術分析方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37C反應1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析TFAR19（PDCD5），前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為

15、探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉位現(xiàn)象，伴隨著細胞核形態(tài)學的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉位。方法：1 懸浮細胞的染色：（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.51106），PBS洗2次，1000rpm10min。（2）3%多聚甲醛冰浴10min，P

16、BS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm10min。（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。（5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4C反應30min（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm 10min。結果觀察：將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。2：貼壁細胞的原位染色（1） 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%80%滿時，凋亡誘導劑

17、處理細胞。（2）將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。（3）將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。結果觀察細胞凋亡檢測1、早期檢測: 1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測2)細胞內氧化還原狀態(tài)改變的檢測3)細胞色素C的定位檢測 4)線粒體膜電位變化的檢測2、晚期檢測： 細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于晚期檢測通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)2) LM-PCR Lad

18、der (連接介導的PCR檢測) 3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)3、生化檢測：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）4） 通過DNA末端轉移酶將帶標記的dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。4、LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測) 當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接

19、瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現(xiàn)象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。其它方法：1）Telemerase

20、Detection (端粒酶檢測) 端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區(qū)重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的檢測 研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節(jié)物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的