標準的-定量Q-PCR儀器的具體使用步驟和操作方法

1、Q-PCR儀器使用具體步驟1. 首先將Mx3000P電源打開，大約1min，將會聽到啟動的聲音。然后打開桌面上的“Mx3000P軟件”，確定軟件界面右下面的聯(lián)機標志呈綠色。如果不是綠色而是紅色，軟件會提示Instrument to PC communications have failed ,這時只需稍等片刻，待儀器自檢完成，會自動連接計算機；2. 在“Mx3000P軟件”的“New Experiment type”彈出框中選擇需要的實驗類型：通常選擇“SYBR? Green(with dissociation curve),點擊“OK鍵”；3. 確定“Mx3000P軟件”界面上面（Selec

2、tion命令下）的鹵鎢燈已經(jīng)打開。綠色說明已經(jīng)打開，黃色說明正在預(yù)熱，紅色說明沒有打開；4. 最好在儀器與光源預(yù)熱20min后開始實驗；5. 在“Plate Setup”里，對96孔板的各空進行設(shè)定。設(shè)定Standard(標準品)、NTC（陰性對照）、Unknown(樣品)等，并選擇正確的通道（FAM,HEX,ROX,Cy5）.對于標準品，設(shè)定其模板濃度，還需要對不同的樣品進行編號?；蛘唿c擊“Import”,導(dǎo)入以前使用的96孔板設(shè)定。具體為：l 首先選擇Welltype中的Unknown，然后選擇下方的ROX、SYBR;l 選擇Reference dye的ROXl 用Replicate sy

3、mbol對每個樣品進行標記（1,2,3，XXX等）6. 切換至“Thermol profile setup”界面,進行PCR循環(huán)的設(shè)定。可以改變各項溫度、時間、循環(huán)數(shù)等，或者刪除、添加特定步驟和循環(huán)?；蛘唿c擊“Import”， 導(dǎo)入以前設(shè)定的PCR程序。表示 表示在這一步結(jié)束時采集熒光信號， 代表在這一步的全過程中都采集熒光信號，一般用作溶解曲線分析。ENDALL7. “ Thermol profile setup ”設(shè)定結(jié)束后，點擊軟件界面右上方的“Run”,軟件界面右下方會出現(xiàn)運行狀態(tài)顯示框“Run Status”, 可以選擇“Turn lamp off at end of run”,點擊

4、“start”開始實驗，彈出“保存文件的對話框”，選擇后保存，彈出另外一個對話框，選擇第二個（預(yù)熱之后跑），另外在運行過程中可通過點擊“Add cycles”來增加擴增的循環(huán)數(shù)，在PCR運行結(jié)束后軟件將自動關(guān)閉鹵鎢燈。8. 在PCR運行的過程中可以點擊“Raw Data plots”,觀察樣品的實時擴增原始結(jié)果。 9. PCR運行結(jié)束后，點擊“Analysis”,在點擊“Results”,軟件將會自動進行結(jié)果分析，也可以點擊手動進行結(jié)果分析。結(jié)果分析：1. 將Q-PCR結(jié)果從電腦中拷出來，在電腦上打開文件；2. 點擊菜單欄的“File”命令，選擇“Convert to New Experime

5、nt type”子命令，彈出“Selection new Experiment type”對話框；3. 在“Selection new Experiment type”對話框中選擇“Comparative Quantitation(Calibrator)命令，將文件轉(zhuǎn)化成分析結(jié)果的模式，點擊OK鍵；4. 彈出“Mx3000P軟件”界面，在“Plate Setup”界面中“首先選擇Welltype中的Unknown，然后選擇下方的ROX、SYBR;選擇Reference dye的ROX5. 將96孔板中的Actin樣品選中，然后在Nomalizing assay 中選擇SYBR；6. 然后對相同模板的樣品標記相同的字母，對相同引物的樣品標記相同的數(shù)字；7. 最后任意（通常選最左側(cè)的）選擇一列，在Well type