PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用[共104頁]

1、PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用,張雪梅 檢驗系臨床生化教研室,主要參考書,CW迪芬巴赫、GS德弗克斯勒美主編 。PCR技術(shù)實驗指南 黃留玉主編。PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用 尹一兵主編。分子診斷學(xué),目 錄,PCR技術(shù)的原理 PCR技術(shù)的衍生技術(shù) 實時熒光PCR技術(shù) PCR技術(shù)的應(yīng)用,一、PCR的基本原理,PCR反應(yīng)體系 PCR過程 PCR的特點,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)體系 PCR過程 PCR的特點,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)體系 PCR過程 PCR的特點,重復(fù)13步 2530輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 D

2、NA加倍,MOVIE,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結(jié)束,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第

3、2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù) 實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù),PCR技術(shù)簡史,核酸體外擴增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 PCR的完善,PCR技術(shù)簡史,核酸體外擴增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 PCR的完善,1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制 然而，采用E-coli DNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯,PCR技術(shù)簡史,核酸體外擴增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 PCR的完善,1988年

4、初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀,實驗步驟,（1）在0.5ml PCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：,（2）PCR反應(yīng)程序,(1) 94變性5min， (2) 94變性1min， (3) 52 退火1min， (4) 72 延伸1min。 (5) 72

5、延伸10min。,重復(fù)(2)-(4)30次,PCR結(jié)果：1、對照(無模板)； 26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）,PCR產(chǎn)物的電泳鑒定,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,（1）模板 單、雙鏈DNA均可，多種來源。 質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般人基因組100ng DNA模板（100L）。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,PCR反應(yīng)的影響因素1)反應(yīng)體系,LambdaDNA，模板量分別為100pg,10pg,1pg,100fg,10fg,（2）引物 引物是與待擴增DNA片斷兩翼互補的一段特異的寡核苷酸片斷。 引物

6、是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的因素，因此引物序列的設(shè)計對于PCR是否成功是非常重要的。,引物設(shè)計的原則： （1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列。,序列的查找可在相關(guān)的網(wǎng)址，如/pubmed 查找各種目的序列。 同源性比較可以在www.ncbi.nih/blast.cgi進行在線比較或通過OMIGA、Clustal X等軟件進行兩兩或多序列的比較。,引物序列同源性比對,（2）引物長度以15-40 bp為宜。 （3）堿基盡可能隨機分布，G+C占50-60%。 （4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。 （5）兩引物間避免有互補序列（二聚體）

7、。 （6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴格限制。,3,5,3,5,限制性內(nèi)切酶的識別序列 啟動子序列 定點突變 探針標記,引物設(shè)計,引物設(shè)計常用軟件主要有： Primer Premier 5.0 Oligo 6 primer 3 The Primer Generator Net Primer,1. 將序列輸入軟件中,兩個方法,（2）打開原有的序列文件,在對話框中輸入待擴增序列 點擊左上角的“Primer”按鈕,2. 設(shè)置相關(guān)參數(shù),3. 得到的引物結(jié)果,Hairpin: 引物自身是否會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) Dimer: 同一種引物是否會形成二聚體 False primiring: 引物在待擴增序列中其他位

8、置是否有配對 Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會形成二聚體,改動后引物的信息,重新回到雙引物的界面,“Edit”“Copy”“Sense Primer” 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3,4. 輸出引物序列,引物純度：公司合成引物常用的純化方式C18脫鹽、OPC 純化、PAGE純化、HPLC純化。 普通PCR：OPC純（95%） 較長引物（大于50個堿基） ：PAGE純（95%） 經(jīng)過修飾或標記的引物：HPLC純（ 99%,但價格昂貴） 引物濃度：0.1-0.5 mol/L，濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配，反應(yīng)特異性下降。,*生物科技有限公司的引

9、物合成服務(wù),（3）耐熱DNA聚合酶,1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ： 95的半壽期為40min 最適溫度（72）時每個酶分子每秒可催化合成150個核苷酸 酶活性（受多種因素影響）： 53方向的聚合酶活性， 53方向的外切酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性， 非模板依賴性活性，可在雙鏈PCR產(chǎn)物每一條鏈的3端加上單核苷酸尾，使PCR產(chǎn)物的3端突出一個單A核苷酸尾,Tth DNA聚合酶：在高溫和MnCl2存在的條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA。用于一步法RT-PCR。 Vent DNA聚合酶：又稱Tli DNA聚合酶，該酶耐高溫且具有3-5外切酶活性的校對功能，其保真性較Taq DNA聚

10、合酶高一倍。該酶擴增長片斷（12kb）的功能較強。 Pfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校對功能，催化DNA合成的忠實性比Taq聚合酶高12倍，但不適于2kb的片斷擴增。,2）其他的耐熱聚合酶,（4）dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2

11、+可與負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,2）循環(huán)參數(shù) 變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 95oC 20-30秒 (2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。,（3）延伸 70-75oC， 延伸時間由擴增片段長度決定 （4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴增效率降低，錯誤摻入率增加,二、PCR的衍生技術(shù),逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 反向PCR（inverse PCR） 巢氏PCR（nesti

12、ng PCR） 原位PCR（in situ PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） 不對稱PCR（asymmertric PCR） 錨定PCR（anchored PCR） 長片段PCR（long fragment PCR） 熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶活性,mRNA,cDNA,雜化雙鏈,PCR擴增,1、逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),影響因素,（1）模板對RT-PCR的影響 對RNA制品的純度和完

13、整性要求都極為嚴格 （2）逆轉(zhuǎn)錄酶對RT-PCR的影響 MLV逆轉(zhuǎn)錄酶能合成大于2kb的較長cDNA，但對熱的穩(wěn)定性較AMV逆轉(zhuǎn)錄酶差。 （3）逆轉(zhuǎn)錄引物對RT-PCR的影響 隨機引物：原核細胞多用 oligo(dT)：真核細胞多用 基因特異性的引物（GSP）：特異性強，廣譜性低,例子： S.pn的轉(zhuǎn)化對PsaA基因mRNA表達的影響,a、RNA的提取： 野生型和轉(zhuǎn)化缺陷型S.pn都誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，采用Qiagen試劑盒進行總RNA提取。 b、cDNA的制備： 取RNA 2l，隨機引物1l，DEPC水9l，混勻后，70變性5min，立即置于冰上。然后順序加入逆轉(zhuǎn)錄buffer 5l，dNTP 1.

14、5l, RNasin 0.5l, DEPC水5l, 逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1l。混勻后于37，1小時，得到cDNA。 c、PCR擴增: PsaA的引物3L，cDNA 1L，Tag plus酶0.2L，共30L體系。循環(huán)參數(shù)：94 30秒，55 40秒，72 45秒，循環(huán)30次。用16s rRNA的PCR產(chǎn)物為標準物，2%瓊脂糖電泳。,電泳結(jié)果用軟件Quantity-one 3.2進行半定量比較，結(jié)果進行配對t檢驗分析,16S(463bp) PsaA(254bp),圖2， 2號菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時間PsaA mRNA的表達。,1 2 3 4 5 6 7,圖1， 2號菌株及其轉(zhuǎn)

15、化缺陷菌株在加入CSP后的不同時間PsaA 的RT-PCR電泳圖。 line1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP.,*,*,*,2、反向PCR (inverse PCR),用反向的引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 應(yīng)用： （1）用于測序的DNA大片段的克隆 （2）獲得啟動子序列 （3）小質(zhì)粒的定點突變

16、 （4）鑒定插入失活基因或體內(nèi)誘導(dǎo)基因,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,反向PCR示意圖,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒引物即可直接對X片斷進行擴增后測序，得到X基因序列信息。（10/64）,例子： S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因序列的獲得,3、多重PCR(multiplex PCR),用于檢測特定基因序列的存在或缺失。,電泳,引物,圖1 第1、2、3組引物多重PCR電泳圖 1：正常對照；2：DL2000 marker；310：檢出的缺失型患者,杜氏/貝克型肌營養(yǎng)不良癥,一種常見的致死性神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見，約占55%65%，缺失分布的位點

17、較多，隨地域及民族的差異而有不同特點,4、突變PCR,（1）隨機突變： 應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個體 策略：易錯PCR（error-prone PCR）。 利用Taq DNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有35校對功能的特性，在PCR擴增反應(yīng)中可能摻入錯誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機錯誤的擴增產(chǎn)物。 加入次黃嘌呤核苷酸并限制某一種核苷酸的用量，從而促進DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或次黃嘌呤核苷酸，導(dǎo)致擴增產(chǎn)物發(fā)生突變。,（2）定點突變,（1）5端引入突變：通過修飾上游引物的5 端，即可引入標記的堿基、限制性酶切位點、啟動子序列等。 （2）序列中的單位點突變：采用重疊延

18、伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR),（A）為5端引入突變 （B）為單堿基突變,例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建,S.Pn的ply為一細胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗： 首先設(shè)計4個引物：（M1和M2完全重疊） P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH I P2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I M1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-T

19、GGGACATTATTGACC-3,以基因組DNA 為模板，以P1和M1為引物擴增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴增出ply下游片斷 以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物，擴出全長 酶切后克隆到質(zhì)粒中保存,（3）多位點突變,策略：多次重疊PCR 關(guān)鍵：重疊引物的設(shè)計（每對突變引物需要部分重疊，方向相反）。,5、原位PCR (In Situ PCR),原位PCR是由Hasse等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增，可

20、進行細胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。,操作步驟 1. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入 2. PCR擴增細胞內(nèi)目的片段 3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物,A.陽性對照,B.陰性對照,C.原位檢測mRNA表達,三、實時熒光PCR技術(shù),通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程； 結(jié)合相應(yīng)的軟 件可以對結(jié)果 進行分析，計 算待測樣品的 初始模板量。,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定義：PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 為什么要用Ct值定量

21、 實時熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。,C(t)值的重現(xiàn)性,相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖 終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性,C(t)與初始模板含量,初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系,定量原理,初始 DNA量越多, 熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值） Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量,確定初始模板的濃度,1、熒光定量PCR標記方法 內(nèi)摻式染

22、料 SYBR Green I 序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,1）內(nèi)摻式染料,SYBR-Green I,優(yōu)點,使用方便 - 不必設(shè)計復(fù)雜的引物 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏,例子：熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌comE基因轉(zhuǎn)錄水平,方法流程： 1、標準品制備：普通PCR擴增出comE基因片斷裝入克隆質(zhì)粒定量稀釋為109拷貝作為標準品備用 2、定量檢測comE基因表達水平：提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA與成10倍梯度稀釋的標準

23、品一起作為模板，同時進行熒光定量PCR根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果得到其表達的絕對量。,圖1 comE基因熒光定量PCR擴增曲線,圖2 comE基因熒光定量PCR融解曲線,表1 D39菌株在CSP誘導(dǎo)后不同時間的comE基因mRNA表達,*：p0.05，CSP誘導(dǎo)10min時comE的表達量較0min和20min時顯著增高,實驗結(jié)果：,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,熒光共振能量傳遞（FRET Probe）,2）序列特異性探針,雙標記探針（Taqman Probe）,優(yōu)點,對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測 與 Molecular Bea

24、cons 相比設(shè)計相對簡單 是目前應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù),SNP檢測,X,分子信標（Molecular Beacon Probe）,引物特異性探針（Amplifluor Probe）,3）引物特異性探針,2、熒光定量實時PCR與普通PCR的比較 靈敏度高 靈敏的熒光檢測較電泳檢測靈敏度高 特異性高 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性 定量準確 全程監(jiān)控，準確的算法進行定量 無需跑膠，自動化程度高,4通道實時熒光定量PCR儀,3、熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。,PCR只是一個簡單的

25、不起眼玩藝 凱利穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。 它最大的特點就是能不斷推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow,PCR技術(shù)的應(yīng)用,研究與生產(chǎn) 基因克隆，DNA測序，分析突變 診斷 細菌、病毒、寄生蟲檢測，腫瘤診斷 法醫(yī) 犯罪現(xiàn)場標本分析 其他,1) 基因克隆,重組質(zhì)粒,酶切,PCR擴增,染色體DNA,連接,基因工程產(chǎn)品,我國已批準生產(chǎn)的部分生物技術(shù)藥物 名稱 作 用 rhu EPO 產(chǎn)生紅細胞

26、rhu IFN1b (外用) 病毒性角膜炎 rhu IFN1b 乙肝、丙肝 rhu IFN2a 乙肝、丙肝、皰疹等 rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝 rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等 rhu IFN2a (栓劑) 婦科病 rhu IFN2b (凝膠劑) 皰疹等 rhu IFN 類風濕 人胰島素 糖尿病 rhu GCSF 刺激產(chǎn)生白細胞 rhu GMCSF 刺激產(chǎn)生白細胞、骨髓移植rhu GH 矮小病 乙肝疫苗 預(yù)防乙肝 rhu EGF(外用) 燒傷、創(chuàng)傷 EGF 衍生物 燒傷、創(chuàng)傷 rhu IL2 癌癥輔助治療 rhu IL2 125Ser 癌癥輔助治療 bFGF(外用) 創(chuàng)傷、

27、燒傷 RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 單 抗乳膏劑 銀屑病 痢疾疫苗 預(yù)防痢疾,Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa)： read length 80-150bp, 1G/run.,2)基因測序,PCR,PCR,3)基因檢測,A,內(nèi)源性病變基因,正常人,A,病 人,外源性基因,正常人 (-),病 人 (+),-地中海貧血癥,擴增阻滯突變系統(tǒng)（ amplification refractory mutation system，ARMS）進行檢測,（1）內(nèi)源性基因檢測遺傳病的診斷,300bp,1000bp,800bp,圖1，珠蛋白ARMS檢測結(jié)果1

28、1、2分別為正常樣本的N產(chǎn)物和M產(chǎn)物，3、5、7為檢測樣本的N產(chǎn)物, 4、6、8為相應(yīng)M產(chǎn)物。,圖2，珠蛋白ARMS檢測結(jié)果2 1為N產(chǎn)物，2為M產(chǎn)物,對照產(chǎn)物861bp,囊性纖維化病(CF),鐮刀型細胞貧血癥,（2）外源性基因檢測病原體的診斷,丙型肝炎病毒（HCV）感染的診斷,HBV感染的傳統(tǒng)診斷主要采用免疫測定法檢測血清標本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（兩對半），免疫學(xué)方法雖然比較簡單，但只能提供血清中的HBV間接證據(jù)，無法證明是否具有傳染性，且敏感性較低。 目前的熒光定量PCR方法多采用TaqMan探針，一般根據(jù)HBV基因中的高度保守序列來設(shè)計，能夠檢測少至10拷貝/mL的HBV DNA