熒光物質(zhì)的熒光特性及其定量分析

1、熒光物質(zhì)的熒光特性及其定量分析指導(dǎo)老師：吳瑩實(shí)驗(yàn)人：王壯同組實(shí)驗(yàn)：戈暢、陸瀟實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2016.5.30一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?測(cè)量熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜；2掌握熒光物質(zhì)的定量測(cè)定方法；3熟悉F-2500（日立）熒光光譜儀結(jié)構(gòu)及操作。二實(shí)驗(yàn)原理（一）熒光的產(chǎn)生過(guò)程熒光是發(fā)射光。物質(zhì)分子或原子在一定條件下吸收輻射能而被激發(fā)到較高電子能態(tài)后，在返回基態(tài)的過(guò)程中將以不同的方式釋放能量。如在分子吸收分光光度法中，受激分子以熱能的形式釋放多余的能量，測(cè)量的是物質(zhì)對(duì)輻射的吸收，屬吸收光譜法；而發(fā)光分析是受激分子或原子以發(fā)射輻射的形式釋放能量，測(cè)量的是物質(zhì)分子或原子自身發(fā)射輻射的強(qiáng)度，屬發(fā)射光譜法。激發(fā)光譜曲線(xiàn)：

2、固定測(cè)量波長(zhǎng)（選最大發(fā)射波長(zhǎng)），化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn)。熒光（發(fā)射）光譜曲線(xiàn)：固定激發(fā)光波長(zhǎng)（選最大激發(fā)波長(zhǎng)），化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)。電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光，所以發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（二）熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1躍遷類(lèi)型：的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；2共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移；3剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素

3、有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有；4取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。（三）熒光分析熒光分析可應(yīng)用于物質(zhì)的定性及定量，由于物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外可見(jiàn)光波長(zhǎng)不同，所發(fā)射熒光波長(zhǎng)也不同，利用這個(gè)性質(zhì)可鑒別物質(zhì)。在一定頻率和一定強(qiáng)度的激發(fā)光照射下，熒光物質(zhì)（稀溶液體系）所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，可進(jìn)行定量分析。（四）熒光光譜儀熒光光譜儀主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。三儀器和試劑儀器：F-2500型熒光光譜儀（日立）。50 mL容量瓶10個(gè)。試劑：羅丹明B儲(chǔ)備液5g/mL；熒光素儲(chǔ)備液5g/mL，羅丹明B未知溶液，熒

4、光素未知溶液。四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按要求分別配置羅丹明B和熒光素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各4個(gè)。2. 選取其中一個(gè)溶液，分別測(cè)繪羅丹明B和熒光素的激發(fā)光譜和熒光光譜，并找到它們各自的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和最強(qiáng)發(fā)射波長(zhǎng)。3分別以羅丹明B和熒光素的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，在相同條件下測(cè)定未知樣品的熒光強(qiáng)度。五結(jié)果處理圖1.羅丹明熒光發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)得到最佳發(fā)射波長(zhǎng)為圖2.羅丹明熒光激發(fā)光譜再以作為固定發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)可以得到最佳激發(fā)波長(zhǎng)在、條件下分別測(cè)量4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)量結(jié)果如下樣品編號(hào)標(biāo)樣濃度（ ）測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度10.0230.2320.0457.86

5、30.0682.6940.08117.9表1.不同濃度羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)量結(jié)果作線(xiàn)性回歸線(xiàn)如下圖3.羅丹明標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R=0.99447，測(cè)量未知羅丹明樣品信號(hào)強(qiáng)度為70.42，帶入工作曲線(xiàn)可以得到未知樣品的濃度為0.048。圖4.熒光素發(fā)射光譜圖測(cè)得熒光素的最佳發(fā)射波長(zhǎng)為圖5. 熒光素激發(fā)光譜圖再以作為固定發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)可以得到最佳激發(fā)波長(zhǎng)在、條件下分別測(cè)量4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)量結(jié)果如下樣品編號(hào)標(biāo)樣濃度（ ）測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度10.014.60320.028.17730.0311.7940.0417.41表2.不同濃度熒光素標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)量結(jié)果圖6.熒光素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R=0.98616，測(cè)量未知羅丹明樣品信號(hào)強(qiáng)度為6.969，帶入工作曲線(xiàn)可以得到未知樣品的濃度為0.017六思考題1. 在測(cè)量熒光光譜曲線(xiàn)時(shí)如何區(qū)分熒光發(fā)射峰和激發(fā)光散射峰？答：熒光峰位置不隨激發(fā)光源波長(zhǎng)變化而變化,散射峰則不然?？梢匀∫粋€(gè)稍不同的激發(fā)波長(zhǎng)判斷。2. 為什么熒光光譜儀要配備2個(gè)單色器？為什么光源與檢測(cè)器通常成直角？答：配備兩個(gè)單色器是為了提高信噪比，測(cè)器處于一直線(xiàn),光源發(fā)出的光可能直接進(jìn)入檢測(cè)器,造成很亮的背景,不利于待測(cè)物所發(fā)熒光的檢測(cè)，所以光源與檢測(cè)器要成直角。3.在發(fā)射波長(zhǎng)