蛋白酶產(chǎn)生菌的分離

1、蛋白酶產(chǎn)生菌的分離、活化選育、發(fā)酵及酶活力的測(cè)定許多細(xì)菌和霉菌產(chǎn)生蛋白酶，細(xì)菌中的芽孢桿菌是常見的蛋白酶產(chǎn)生菌。本實(shí)驗(yàn)將土壤樣品懸液加熱處理，殺死非芽孢細(xì)菌及其它微生物后進(jìn)行劃線分離得到芽孢桿菌，將其接種到酪蛋白平板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)酪蛋白平板的水解圈做初篩。也可直接將細(xì)菌或霉菌接種到酪蛋白平板進(jìn)行培養(yǎng)，分離篩選其它蛋白酶產(chǎn)生菌。本實(shí)驗(yàn)主要包括：蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化、產(chǎn)酶微生物菌種的選育、產(chǎn)酶微生物的發(fā)酵與酶活力的測(cè)定、蛋白酶產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)及生長(zhǎng)曲線、培養(yǎng)基優(yōu)化。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，使學(xué)生學(xué)會(huì)從自然界中分離蛋白酶產(chǎn)生菌的方法，菌種的純化技術(shù)、高產(chǎn)菌的選育技術(shù)；了解蛋白酶產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)情況，學(xué)會(huì)繪制其生長(zhǎng)

2、曲線；學(xué)會(huì)培養(yǎng)基優(yōu)化的方法；了解蛋白酶的性質(zhì)及蛋白酶的測(cè)定原理；掌握蛋白酶的發(fā)酵及酶活力測(cè)定方法。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)樣品校園內(nèi)土壤樣品1.2實(shí)驗(yàn)儀器與材料牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、酪蛋白平板、無(wú)菌水（帶玻璃珠）、芽孢染色液番紅；顯微鏡、恒溫水浴鍋、酒精燈、接種針、游標(biāo)卡尺、無(wú)菌移液管、無(wú)菌試管、血球計(jì)數(shù)板、試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、，玻棒、電子天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH5590）、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、培養(yǎng)皿、膠頭滴管、分光光度計(jì)（應(yīng)符合GB9721的規(guī)定）等。2實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.1培養(yǎng)基的配制方法1.稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱藥品放入燒杯中。2.溶化在上

3、述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。3.調(diào)pH4.分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。5包扎塞好棉花的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆扎，用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。6滅菌將上述培養(yǎng)基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），1213，15-20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。7制作平板將滅菌后的培養(yǎng)基冷凝至5560,放在超凈臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，以鋪

4、滿皿底為度。8無(wú)菌檢查待培養(yǎng)基凝固后，5個(gè)培養(yǎng)皿一疊，倒置平放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。2.2蛋白酶產(chǎn)生菌的分離1）采集土壤樣品，用無(wú)菌水制備1：10土壤懸液；2）取1：10土壤懸液5ml，注入已滅過(guò)菌的試管中，將此試管放入75-80水浴中熱處理10min，以殺死非芽孢細(xì)菌；3）取加熱處理過(guò)的土壤懸液100-200L，涂布接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，將平板倒置，于30-32培養(yǎng)24-48h；4）對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行編號(hào)，選擇表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少許菌苔涂片，做芽孢染色，判斷是否為芽孢桿菌。2.3蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選1）從判定為芽孢桿菌的菌落處，分別挑取少許

5、菌苔，先接種含酪蛋白的斜面培養(yǎng)基，再點(diǎn)接于含酪蛋白的平板，30-32培養(yǎng)24-48h，測(cè)定平板上菌苔直徑和水解圈直徑。2）水解圈直徑與菌落直徑比值大的那個(gè)菌株對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)物，可作為進(jìn)行誘變選育或酶發(fā)酵、酶活力測(cè)定菌株。2.4蛋白酶產(chǎn)生菌的選育2.4.1紫外線對(duì)出發(fā)菌株的誘變效應(yīng)1）菌懸液的制備：取培養(yǎng)48小時(shí)生長(zhǎng)旺盛的出發(fā)菌株斜面4-5支，用10ml無(wú)菌生理鹽水將菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2-3次，最后制成菌懸液。用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)

6、。2）平板制作：將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時(shí)倒平板27套，凝固后待用。3）紫外線處理：將紫外線燈開關(guān)打開，預(yù)熱約20分鐘。取直徑6cm無(wú)菌平皿2套，分別加入上述調(diào)整好細(xì)胞濃度的菌懸液3ml，并放入一根無(wú)菌攪拌棒于平皿中。將上述2套平皿先后置于磁力攪拌器上，打開皿蓋，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘和3分鐘。蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。4）稀釋：在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無(wú)

7、菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。6）培養(yǎng)：將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。7）計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。8）觀察誘變效應(yīng)：將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5-6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說(shuō)明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩

8、用。2.5蛋白酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵與酶活力測(cè)定2.5.1蛋白酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵（1）將保藏培養(yǎng)基中的產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌接種兩環(huán)到種子培養(yǎng)液中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)16h,4冰箱保存。（2）取10ml含產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液接入含100ml酪素液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)，作為樣一。（3）樣一培養(yǎng)12h后，再取10ml含產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液接入含100ml酪素液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)，作為樣二。（4）在發(fā)酵培養(yǎng)的48h內(nèi)，每3h取一次樣，每次取5ml,放入10ml的離心管中，于4冰箱冷藏。（5）48h后將所有取樣3000rpm離

9、心10min，離心所得上清液680nm進(jìn)行酶活力測(cè)定，每管沉淀加5ml蒸餾水600nm測(cè)生長(zhǎng)曲線。2.5.2試劑和溶液2.5.2.1福林試劑2.5.2.2碳酸鈉溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L稱取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL.2.5.2.3三氯乙酸c(CCl3COOH)=0.4mol/L稱取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。2.5.2.4氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。2.5.2.5鹽酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L按GB601配制。2.5.2.6緩沖溶液a磷酸緩沖液(pH=7.5)，

10、適用于中性蛋白酶稱取磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO42H20)0.5g，加水溶解并定容至I000mL2.5.2.710g/L酪素溶液稱取酪素1.000g，精確至0.00lg，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液(若酸性蛋白酶則用濃乳酸2-3滴)濕潤(rùn)后，加人適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)人100mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。2.5.2.8l00g/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液a.稱取預(yù)先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，

11、用lmol/L鹽酸60mL溶解后定容至l00mL，即為lmg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。b.吸取lmg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到l00g/mLL一酩氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.5.3分析步驟2.5.3.1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制a.L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：管號(hào) 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度g/ml 取100g/mlL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積取水的體積ml000101101922028330374404655055b.分別取上述落液各1.00mL(做平行試驗(yàn))，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00mL,福林試劑使用溶液1.00mL，置于40士0.2水浴中顯色20

12、min，取出，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680nm,10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(此線應(yīng)通過(guò)零點(diǎn))。根據(jù)作圖或用回歸方程計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(g)，即為吸光常數(shù)K值。2.5.4酶活力的測(cè)定a.先將酪素溶液放人40C士2C恒溫水浴中，預(yù)熱5minb.按下列程序操作:步驟試管A(空白)試管B(酶試樣，做3個(gè)平行試樣)1加酶液1.00ml（離心上清液）加酶液1.00ml（離心上清液）2400.2,水浴2min400.2,水浴2min3加三氯乙酸2.00ml(搖勻)加酪素1.00ml(搖勻)4400.2,10m

13、in400.2,10min5加酪素1.00ml(搖勻)加三氯乙酸2.00ml(搖勻)6取出靜止10min,過(guò)濾取出靜止10min,過(guò)濾7取1.00ml濾液取1.00ml濾液8加碳酸鈉溶液5.0ml加碳酸鈉溶液5.0ml9加福林試劑使用液1.00ml加福林試劑使用液1.00ml10400.2,顯色20min400.2,顯色20min11于680nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度于680nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度2.5.4.2計(jì)算X=A*K*4/10*n=2/5*A*K*n式中:X一一樣品的醉活力，u/g(u/mL)tA一一樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度;K一吸光常數(shù);4一反應(yīng)試劑的總體積,mL10一一反應(yīng)時(shí)間10min，以l

14、min計(jì);n一一稀釋倍數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化（正交實(shí)驗(yàn)）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用正交表來(lái)安排與分析多因素試驗(yàn)的一種設(shè)計(jì)方法。它是由試驗(yàn)因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)的，通過(guò)對(duì)這部分試驗(yàn)結(jié)果的分析了解全面試驗(yàn)的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本特點(diǎn)是：用部分試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況。 正因?yàn)檎辉囼?yàn)是用部分試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)的，它不可能像全面試驗(yàn)?zāi)菢訉?duì)各因素效應(yīng)、交互作用一一分析；當(dāng)交互作用存在時(shí)，有可能出現(xiàn)交互作用的混雜。雖然正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)有上述不足，但它能通過(guò)部分試驗(yàn)找到最優(yōu)水平組合 ，因 而 很 受實(shí)際

15、工作者青睞。 例如下表為一培養(yǎng)基優(yōu)化的4因素3水平簡(jiǎn)表4因素3水平表 因素水平蔗糖（%）NH4NO3 （%）KH2PO4 （%）MgSO47H2O （%）ABCD1100.10.050.12150.20.10.253200.30.30.52.7產(chǎn)蛋白酶菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定2.7.1獲取不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液2.7.1.1 整點(diǎn)8:00時(shí)，準(zhǔn)時(shí)接入已經(jīng)活化好的對(duì)數(shù)期菌種，用1000ul 的移液槍吸取5ml的對(duì)數(shù)期菌液加入到發(fā)酵瓶A中（液體為酪素培養(yǎng)基），剩下的對(duì)數(shù)期菌種菌液置于4冰箱種中保藏于。并同時(shí)將A號(hào)發(fā)酵瓶放到搖床中，繼續(xù)30震蕩發(fā)酵。在直到20:00時(shí)將放在冰箱中保藏的菌種液（活化的對(duì)數(shù)期菌種）

16、取出5ml接種到B號(hào)發(fā)酵瓶中。并放在30的搖床中繼續(xù)發(fā)酵。2.7.1.2 在8：00時(shí)，將放在冰箱中保藏的菌種液（活化的對(duì)數(shù)期菌種）取出5ml接種到C號(hào)發(fā)酵瓶中。立即從A、B、C號(hào)瓶移取發(fā)酵液5ml到對(duì)應(yīng)的離心管中。A瓶取樣分別對(duì)應(yīng)的編號(hào)是12、13、14、15、16、17、18對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間為24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h。B瓶取樣分別對(duì)應(yīng)的編號(hào)是6、7、8、9、10、11對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間為12h、14h、16h、18h、20h、20h完成全部取樣。C瓶取樣分別對(duì)應(yīng)的編號(hào)是0、1、2、3、4、5對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間為0h、2h、4h、6h、8h、10h。并且全部放到4冰箱封存。2.7.2 吸光度值的測(cè)定將編號(hào)0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的離心管從冰箱里取出，用離心機(jī)在設(shè)定的轉(zhuǎn)速為3500rpm,離心10min,將要測(cè)酶活力的的編號(hào)的上清液倒入另一干凈的試管中。沉淀留下。（2） 離心管中加入蒸餾水5ml輕微震蕩制成懸浮液。（3） 將懸浮液加到比色皿中，測(cè)其吸光度值。 測(cè)定的OD600值填入下表。 編號(hào)對(duì)照012345678發(fā)