分子遺傳學(xué)第6章 蛋白質(zhì)翻譯.ppt

1、1,6.1 基本概念 6.2 遺傳密碼 6.3 tRNA的功能 6.4 核糖體的結(jié)構(gòu) 6.5 原核生物的翻譯過(guò)程 6.6 真核生物的翻譯過(guò)程 6.7 翻譯初始產(chǎn)物的后加工,第6章 蛋白質(zhì)翻譯 （Protein Translation）,2,3,4,典型的酶作用機(jī)制,酶等待著被作用的分子來(lái)臨,成為一個(gè)新分子放出來(lái),5,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：又稱初級(jí)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)，是指組成蛋質(zhì)分子的多肽鏈中氨基酸的數(shù)目、種類和排列順序，多肽鏈的數(shù)目，同時(shí)也包括鏈內(nèi)或鍵間二硫鍵的數(shù)目和位置等。,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈本身折疊和盤繞方式，是指蛋白質(zhì)分子中的肽鏈向單一方向卷曲而形成的有周期性重復(fù)的主體結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。,蛋

2、白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：是指在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步卷曲折疊，構(gòu)成一個(gè)很不規(guī)則的具有特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。,蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)：是由兩條或兩條以上的具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽聚合而成特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。構(gòu)成功能單位的各條肽鏈，稱為亞基，一般地說(shuō)，亞基單獨(dú)存在時(shí)沒(méi)有生物活力，只有聚合成四級(jí)結(jié)構(gòu)才具有完整的生物活性。,6,7, 基因表達(dá)的第二步, 指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位 點(diǎn)開(kāi)始，按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原 則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程, 參與翻譯的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA, tRNA 通過(guò) anti-codon(反密碼子) 識(shí)別codon,6.1 基本概念, tRNA的

3、功能是轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸， mRNA作為翻譯的 模板， rRNA與多種蛋白質(zhì)組成核糖體作為蛋白 質(zhì)合成的場(chǎng)所,翻譯的起始,核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物,蛋白質(zhì)的生物合成是一個(gè)比DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜的過(guò)程。,Polycistronic transcripts in prokaryotes,9,核糖體沿mRNA5 端向3 端移動(dòng)，開(kāi)始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中速度最快的階段,肽鏈的延伸,10,肽鏈的終止及釋放,核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng),11,6.2.1 通用遺傳密碼(Universal triplet codon),特征, codon是m

4、RNA 上連續(xù)排列的三個(gè)核苷酸序列， 并編碼一個(gè)氨基酸信息的遺傳單位, codon具有四大生物系統(tǒng)（細(xì)菌、病毒、動(dòng)物、植物） 的通用性與保守性（除mt）, 在一個(gè)基因序列中 codon具有不重疊性和無(wú)標(biāo)點(diǎn)性,6.2 遺傳密碼(genetic codon),遺傳密碼是三聯(lián)體的推測(cè) 1954年俄裔美國(guó)大爆炸理論物理學(xué)家伽莫夫 （G.Gamow）在自然雜志發(fā)表 脫氧核糖核酸與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系 論文，提出遺傳密碼的構(gòu)想，認(rèn)為在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，四個(gè)堿基之間形成一定空穴,游離氨基酸進(jìn)入空穴形成多肽鏈，四個(gè)堿基中由三個(gè)堿基決定一種氨基酸，因?yàn)榘被嵊?0種。 一個(gè)堿基決定一種氨基酸時(shí)只能決定41 =

5、4種 兩個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸時(shí)只能決定42=16種 三個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸時(shí)能決定43=64種 四個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸時(shí)能決定44=256種,13,遺 傳 密 碼,閱讀方向?yàn)?-3,14,20種氨基酸側(cè)鏈集團(tuán)的大小和極性,15,起始密碼的確定： 1966年，劍橋分子研究中心A.J.Clark等發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)進(jìn)行合成的多肽鏈，其開(kāi)頭在細(xì)菌都為甲酰甲硫氨酸，在真核生物都為甲硫氨酸，且都是從AUG這個(gè)密碼子開(kāi)始，因此，把AUG定為起始密碼子。,終止密碼子的推測(cè)： Nirenberg 、Khorana的試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)UAA、UAG、UGA三個(gè)密碼子不能代表任何的氨基酸。 E.Coli的Trp 突變株不能合成色

6、氨酸合成酶蛋白，對(duì)他進(jìn)行誘變可得到回復(fù)突變，回復(fù)突變有兩種類型：個(gè)別氨基酸發(fā)生了變化。另一種為完全回復(fù)，沒(méi)有任何氨基酸組成的變化。說(shuō)明Trp不是 任何移碼突變 ，從后一種推測(cè)可能存在終止密碼,17,終止密碼子的破譯： 1965年劍橋分子研究中心的Brenner,發(fā)現(xiàn) E.coli一些無(wú)義突變型是在色氨酸位置上變化,由UGG 變成UGA，把UGA定為終止碼 在酪氨酸位置上變化，由UAC 、UAU變成UAA、UAG， 所以把UAA、UAG碼子也定為終止密碼,密碼子通用性的例外情況 密碼子 通用情況 例外情況 例外的生物 UGA 終止子 色氨酸 人酵母線粒體支原體 UGA 終止子 半胱氨酸 纖毛蟲(chóng)核

7、基因組 CUA 亮氨酸 蘇氨酸 酵母線粒體 AUA 異亮氨酸 甲硫氨酸 人線粒體 AGA 精氨酸 終止子 人線粒體 AGG 精氨酸 終止子 人線粒體 GUG 纈氨酸 絲氨酸 假絲酵母核基因組 UAA 終止子 谷氨酸 草履蟲(chóng)四膜蟲(chóng)核G UAG 終止子 谷氨酸 草履蟲(chóng)核G AAA 賴氨酸 天冬氨酸 果蠅線粒體 CUG 亮氨酸 終止子 圓柱念珠菌核G CUN 亮氨酸 蘇氨酸 酵母線粒體,19,2、第二遺傳密碼 （表觀遺傳密碼） 決定多肽鏈折疊形成有功能蛋白質(zhì)的遺傳信息， 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其空間結(jié)構(gòu)的密碼,20,由DNA序列以外的化學(xué)標(biāo)記編寫(xiě)的、控制表觀遺 傳印記的另一類遺傳密碼,遺傳密碼是遺傳信息

8、從DNA RNA 流向蛋白質(zhì)， 是明碼，又叫第一遺傳密碼，是遺傳信息傳遞的第 一層次 第二遺傳密碼是遺傳信息從蛋白質(zhì)氨基酸序列到蛋 白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)功能，也既蛋白質(zhì)分子折疊是遺傳 信息傳遞的第二層次 中心法則解決了蛋白質(zhì)的形成，但沒(méi)有解決蛋白質(zhì) 如何折疊形成功能蛋白質(zhì)，給后人留下了新的難 題，從遺傳信息到生物功能研究就是研究蛋白質(zhì)分 子折疊機(jī)制，既破譯第二遺傳密碼,22,我國(guó)中科院院士皺承魯領(lǐng)銜此課題， 有望破譯。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)第二遺傳密碼有三個(gè)特性 簡(jiǎn)并性：不同序列對(duì)應(yīng)相同結(jié)構(gòu) 多義性：類似序列具有不同結(jié)構(gòu) 全局性：局部序列改變會(huì)影響整個(gè)結(jié)構(gòu),23,6.2.2 Degeneracy of codo

9、n (密碼子的簡(jiǎn)并性),（1） 概念,密碼子的簡(jiǎn)并性：多種codons編碼一種氨基酸的現(xiàn)象,同義密碼子(synonyms)：代表同一種氨基酸的密碼子,61個(gè)密碼子編碼常規(guī)的20種氨基酸，3個(gè)為肽鏈終止密碼子,簡(jiǎn)并性具有的生物學(xué)意義：允許生物體的DNA堿基有較大變異的余地，使基因突變可能造成的危害降至最低，而不影響物種性狀的表達(dá)，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和物種遺傳的穩(wěn)定。,多個(gè)遺傳密碼編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象 簡(jiǎn)并的例子 氨基酸 密碼子數(shù) 氨基酸 密碼子數(shù) 絲氨酸 6 天冬氨酸 2 亮氨酸 6 酪氨酸 2 精氨酸 6 組氨酸 2 脯氨酸 4 谷氨酸 2 蘇氨酸 4 賴氨酸 2 丙氨酸 4 谷氨酰胺 2 甘氨

10、酸 4 天冬酰胺 2 纈氨酸 4 半胱氨酸 2 異亮氨酸 3 色氨酸 1 終止碼 3 甲硫氨酸 1 苯丙氨酸 2,25,（2） 簡(jiǎn)并現(xiàn)象的機(jī)理, 同功受體（Isoacceptor ）： 負(fù)載同一氨基酸，但識(shí)別 不同密碼子的tRNA。 同功tRNA間存在結(jié)構(gòu)上的差異，反密碼子也可不同, Wobble hypothesis; tRNA 的 反密碼子中 : 密碼子 1th(Nt34) : 3 rd-Nt,3 isoacceptors,1 codon family 2 extra codons,26,Wobble base的搖擺配對(duì)原則,擺動(dòng)假說(shuō)由Crick. F 1966年 提出。即當(dāng)tRNA的反密

11、碼子與mRNA的密碼子配對(duì)時(shí)前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)法則，但第三對(duì)堿基有一定的自由度可以“擺動(dòng)”。,27,3）簡(jiǎn)并性的相對(duì)性 雙關(guān)密碼子:（ambiguous codon）多義密碼子 能編碼一種以上氨基酸的密碼子 例如密碼子UUU能編碼笨丙氨酸，偶而 也能編碼亮氨酸。機(jī)制在于UUU碼子可 被一種以上tRNA識(shí)別，也說(shuō)明很早以 前UUU就是亮氨酸的密碼子,28,6.2.3 Anti-codon及其兩側(cè)堿基修飾對(duì)密碼子 解讀的生物學(xué)意義,Xo5U (5-羥基尿苷) Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷) mCm5U (5-甲氧基羰甲基尿苷) Xm5s2U (5-甲基-2硫代尿苷) K2C (2-

12、賴氨酸胞苷) Com5U (5(2)-羥羧甲基尿苷) I (Inosine次黃嘌呤),m7G (7-甲基鳥(niǎo)苷) m5C (5-甲基胞苷) m6A (6-甲基腺苷) s2C (2-硫代胞苷) (假尿苷) Um (2-O-甲基尿苷) Q (Queuosine),a) Methylated Nt at anti-codon and flanked,29,Xo5U (5-羥基尿苷) Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷) mCm5U (5-甲氧基羰甲基尿苷) Xm5s2U (5-甲基-2硫代尿苷) K2C (2-賴氨酸胞苷) Com5U (5(2)-羥羧甲基尿苷) Um (2-O-甲基尿苷) I (I

13、nosine次黃嘌呤),30,c) tRNA中anti-codon堿基修飾的意義, 限制對(duì)密碼識(shí)讀的隨意性，以保證遺傳的穩(wěn)定, 提高搖擺能力，防止突變效應(yīng)，以保證遺傳的穩(wěn)定,保證正確的讀碼框架，以保證遺傳的穩(wěn)定,anti-codon兩側(cè)的堿基亦被稱為擴(kuò)展的反密碼子,31,6.3 tRNA的功能,為每個(gè)三聯(lián)體密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體 為準(zhǔn)確無(wú)誤將所需aa運(yùn)送到核糖體提供了運(yùn)送載體 tRNA種類繁多，并與多種蛋白質(zhì)和核酸相互識(shí) 別，決定了它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上存在大量的共性,tRNA的結(jié)構(gòu)“四環(huán)一臂” 倒L形的三級(jí)結(jié)構(gòu),33,沉降系數(shù) S 生物大分子在離心場(chǎng)中沉降，受到三種力的影響，它們是離心力，浮力

14、和摩擦力。物質(zhì)在單位離心力場(chǎng)的沉降速度是個(gè)定值，稱為沉降系數(shù)（sedimentation coefficient） 。 蛋白質(zhì)、核酸等的沉降系數(shù)在1 X 10-13到 200 X 10-13秒 之間。為方便將10-13秒作為一個(gè)單位，稱Svedberg單位，用S表示。 其數(shù)值不僅與物質(zhì)分子的質(zhì)量有關(guān)，也與分子的形狀有關(guān)。,34, 小RNA; 4S, tRNA phe, 77Nt , cloverleaf form (1964 Holly R.), 二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形 5 arms codon usage (codon bias) 是進(jìn)化中形成的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制之一,47,1209 codons

15、,48,Codon usage in the genes of Animals,2244 codons,49,6.3.6 two of three codon-reading in mitochondrial,a) 線粒體中具有與通用密碼不同的編碼信息, 線粒體中codon較為整齊（均為2/4/6）,2 codon; F, I, Y, H, Q, N, E, k, D,W, M, C 1個(gè)tRNA 4 codon; V, P, T, A, R, G, (family) Leu, Ser (2 isoacceptors each) 2個(gè)tRNA, In mt 22 tRNA only (32 t

16、RNA in universal codons),線粒體“三中讀二”方式可減少tRNA,50,51, Codon-reading,two of three reading,codon UCU-UCA-UCG-UCC,搖擺性的“三中讀二”原則： 密碼子的1、2位堿基與反密碼子能形成6個(gè)氫鍵 時(shí)，可三中讀二，如：CCX,CGX,GCX,GGX 密碼子的1、2位堿基與反密碼子能形成4個(gè)氫鍵 時(shí)，不可三中讀二， AAX,AUX,UAG,UUX 密碼子的1、2位堿基與反密碼子能形成5個(gè)氫鍵時(shí) 分兩種情況：當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘧啶時(shí)可三中讀二， 如 UCX,ACX,CUX,GUX。當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘌呤時(shí) 不可三中

17、讀二，如CAX,GAX,UGX,AGC 原核生物、真核生物只有大約30種反密碼子，而密 碼子卻有61種，反密碼子少的原因就在于反密碼子 具有搖擺的特性,53, mt tRNA 與通用 密碼 tRNA 的結(jié)構(gòu)差異,- no TC loop in mt-tRNA,- no DHU loop in some mt-tRNA,-G+C/A+U = 0.250.94 in mt-tRNA,G+C/A+U = 12 in universal tRNA U含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)松弛，對(duì) codon family的識(shí)讀具有更大的搖擺性。,54,所有mRNA都具有兩個(gè)必須特征： 一段可翻譯的密碼子序列（開(kāi)放閱讀框，o

18、pen reading frame，ORF）和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site, RBS） 在原核生物和真核生物間有重要區(qū)別 原核生物mRNA的第一個(gè)密碼子AUG上游的重要特征是SD序列 真核生物mRNA除第一個(gè)密碼子AUG的上游是核糖體小亞基掃描AUG的信號(hào)序列（CCACC）外，5端非翻譯區(qū)上游為帽子結(jié)構(gòu)， 3端非翻譯區(qū)內(nèi)有多聚腺苷化的信號(hào)AAUAAA以及其下游的多聚A尾巴,6.3.7 mRNA,55, In Prokaryote,Shine-Dalgarno seq. (S.D seq)：只存在于原核生物中，在mRNA起始密碼子AUG的上游約10個(gè)核苷酸處含有

19、一段富含嘌呤核苷酸的序列，能與16S rRNA3末端的富含嘧啶的序列結(jié)合。前導(dǎo)序列（leading sequence) 不同基因的SD序列不完全相同，從而控制翻譯產(chǎn)物的數(shù)量,poly-cistron：即參與一個(gè)代謝途徑的若干基因編碼在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)，具有多個(gè)ORF。 ORF：按照一定的閱讀框，從起始密碼到終止密碼子可連續(xù)解讀遺傳密碼的區(qū)域。 閱讀框：解讀mRNA中遺傳密碼的三聯(lián)體方式。,56,57,In Eukaryote,58, In Eukaryote,mono-cistron,59,6.4 核糖體的結(jié)構(gòu),在一個(gè)生長(zhǎng)旺盛的細(xì)菌中，大約有2萬(wàn)個(gè)核糖體。其中蛋白質(zhì)占細(xì)胞總蛋白的10，RNA占

20、細(xì)胞總RNA的80 真核生物中核糖體的數(shù)量更多，蛋白質(zhì)和RNA占細(xì)胞總蛋白質(zhì)和總RNA相當(dāng)大比例,60,核糖體的結(jié)構(gòu),61,62,核糖體:由幾十種蛋白質(zhì)和幾種RNA組成的亞細(xì)胞顆粒，基本不含脂肪,核糖體的組裝,所有核糖體蛋白都首先在細(xì)胞質(zhì)中被合成，運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)，在核仁中被裝配成40S和60S核糖體亞基，然后運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中行使作為蛋白質(zhì)合成機(jī)器的功能,64,Ribosomes,70S (2.5M),80S (4.2M),50S (1.6M),30S (0.9M),60S (2.8M),40S (1.4M),5S rRNA (120 nt) 23S rRNA (2900 nt) 34 prote

21、ins,16S rRNA (1540 nt) 21 proteins,5S rRNA (120 nt) 28S rRNA (4700 nt) 5.8S rRNA (160 nt) 49 proteins,18S rRNA (1900 nt) 33 proteins,Prokaryotes,Eukaryotes,65,Complete initiation Complex of translation,Translation domain,Exit domain menbrane,Exit site,5s site,轉(zhuǎn)肽酶中心，形成肽鍵,P site,A site,EF-G site,EF-Tu

22、 site,mRNA site,20 Nt,肽基轉(zhuǎn)移部位,結(jié)合或接受 aatRNA部位,8個(gè)重要的功能域或位點(diǎn)： 小亞基與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)； 大亞基與氨?；鵷RNA結(jié)合的位點(diǎn)A； 大亞基與肽鏈結(jié)合的位點(diǎn)P； 空載tRNA離開(kāi)核糖體的出口位點(diǎn)E； 大亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域； EF-Tu進(jìn)入核糖體的位點(diǎn)； EF-G結(jié)合位點(diǎn)； 大亞基與5S rRNA結(jié)合位點(diǎn)。,66,核糖體有兩個(gè)結(jié)合攜帶氨基酸的tRNA 的位點(diǎn),P位點(diǎn)：結(jié)合多肽鏈-tRNA A位點(diǎn)：氨酰-tRNA進(jìn)入的位點(diǎn),67,原核生物和真核生物的翻譯過(guò)程分為三個(gè)階段： 起始（initiation） 延伸（elongation） 終止（term

23、ination）,6.4 原核生物的翻譯過(guò)程,68,6.4.1 起始,IF-1 9.5kd 熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，加強(qiáng)IF-2、IF-3的酶活 IF-2 95kd-117kd 熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，促使fMet-tRNA fmet (起始tRNA)選擇性的結(jié)合在30S亞基上 IF-3 20kd 促使30S亞基結(jié)合于mRNA起始部位， 穩(wěn)定游離的30S亞基，使其不與50S亞 基結(jié)合成70S的顆粒,即核糖體的大小亞基、tRNA和mRNA在起始因子的協(xié)助下組合成70S起始復(fù)合物的過(guò)程,（1）起始因子(initiation factor，IF),IF并不牢固結(jié)合于核糖體，在起始復(fù)合物形成后就很快解離,69,(2)

24、起始tRNA與起始密碼子的識(shí)別,起始密碼子為 AUG，細(xì)菌中有時(shí)也用GUG和UUG。但三種起始密碼子的使用效率不同。用GUG代替AUG起始效率下降一半；用 UUG代替GUG起始效率又下降一半 AUG和GUG作為起始密碼子代表甲酰化甲硫氨酸；位于內(nèi)部時(shí)AUG代表甲硫氨酸，GUG代表纈氨酸 甲硫氨酸有兩種tRNA，一種識(shí)別起始AUG，另一種識(shí)別延伸過(guò)程中的AUG 在細(xì)菌和真核生物的細(xì)胞器，起始tRNA攜帶的是甲?；募琢虬彼?fMet-tRNAf)。內(nèi)部的AUG由Met-tRNA識(shí)別,70,(3) 起始復(fù)合物與70S核糖體的形成,A. IF3促進(jìn)70S亞基的解離，并與30S亞基結(jié)合。結(jié)合有IF3因

25、子的30S亞基與mRNA結(jié)合,B. IF2結(jié)合于起始tRNA，然后IF2再與30S亞基結(jié)合，或者順序顛倒。在IF2與起始tRNA形成的二元復(fù)合物結(jié)合于30S亞基后，GTP分子立即與30S亞基結(jié)合。,C. 50S亞基結(jié)合上來(lái)，GTP水解，釋放出的能量改變了30S亞基和50S亞基的構(gòu)象，促進(jìn)70S核糖體亞基的形成，同時(shí)釋放出IF3和IF2因子。,71,6.4.2 肽鏈的延伸,肽鏈的延伸以氨?；鵷RNA進(jìn)入70S起始復(fù)合物（進(jìn)位） 的A位為標(biāo)志，這一過(guò)程需要延伸因子(elongation factor， EF)參與 細(xì)菌中的延伸因子為EF-Tu (熱不穩(wěn)定) 、EF-Ts (熱穩(wěn)定) 、 EF-G(

26、又叫轉(zhuǎn)位因子，依賴GTP),（1） 延伸因子,EF-Tu只有在氨?；鵷RNA進(jìn)位時(shí)才能與核糖體結(jié)合， 進(jìn)位完成后從核糖體上解離下來(lái)，參與下一個(gè)進(jìn)位過(guò)程， 是一個(gè)典型的輔助因子,72,A. 轉(zhuǎn)肽與肽鍵的形成,EF-Tu首先與GTP結(jié)合，然后與氨酰基tRNA結(jié)合形成三元復(fù)合物，此三元復(fù)合物才能進(jìn)入核糖體的A位。GTP的存在是氨?；鵷RNA能夠進(jìn)入A位的先決條件之一，不需要GTP的水解,一旦進(jìn)入A位后，GTP立即水解成GDP，EF-Tu、GDP二元復(fù)合物就與氨?；鵷RNA解離而釋放出來(lái),(2) 延伸過(guò)程,然后肽基轉(zhuǎn)移酶把位于P位的甲酰甲硫氨?；螂幕D(zhuǎn)移到A位的氨?；鵷RNA的氨基上并形成第一個(gè)肽鍵

27、或新的肽鍵,B. 轉(zhuǎn)位,肽鍵形成后，轉(zhuǎn)位因子EF-G和GTP結(jié)合上來(lái)。核糖體中具有GTP酶活性的蛋白質(zhì)將GTP水解，在A位生成的肽基tRNA轉(zhuǎn)移到P位，同時(shí)將原來(lái)P位上空載的tRNA逐出核糖體，mRNA移動(dòng)一個(gè)密碼子，核糖體沿mRNA5 3方向移動(dòng)，每次移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，同時(shí)一個(gè)新的密碼子進(jìn)入空的A位， EF-G 催化的移位過(guò)程需水解GTP提供能量。 肽鏈合成從N-C。,轉(zhuǎn)位后EF-G和GDP必須釋放出來(lái)，下一個(gè)氨?；鵷RNA的三元復(fù)合物才能進(jìn)入A位,能使核糖體停在轉(zhuǎn)位后的狀態(tài)，因?yàn)樗€(wěn)定了EF-G GDP與核糖體的復(fù)合物，使下一個(gè)氨基酸不能加到肽鏈上來(lái),74,C. 兩類延伸因子的交替作用

28、,只有EF-Tu離開(kāi)核糖體后，EF-G和GTP才能結(jié)合上來(lái)；同樣，只有EF-G離開(kāi)核糖體后，新的氨酰基tRNA三元復(fù)合物才能進(jìn)入A位,只有當(dāng)P位點(diǎn)被肽基tRNA占據(jù)而A位點(diǎn)空著時(shí)，氨?；鵷RNA三元復(fù)合物才能進(jìn)入A位；只有當(dāng)肽鍵生成后，肽基轉(zhuǎn)移到A位的氨酰基tRNA上，P位tRNA空載， EF-G和GTP才能結(jié)合到核糖體上來(lái),75,D. Ts循環(huán),EF-Ts的作用：使用過(guò)的EF-Tu-GDP能夠轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏玫男问紼F-Tu-GTP 。,76,77,6.4.3 終止和肽鏈的釋放,原核生物和真核生物都有三種終止密碼子UAG(amber，琥珀密碼子)、UAA(ochre，赭石密碼子)、UGA(opal

29、，乳石密碼子) 在細(xì)菌中，UAA使用頻率最高，UGA次之，UAG最低 沒(méi)有一種tRNA能與終止密碼子作用，而是由特殊的蛋白質(zhì)因子促成終止作用，稱為釋放因子（releasing factor，RF） 原核生物有三種釋放因子：RF1（識(shí)別UAA和UAG）、RF2（識(shí)別UGA和UAA）、RF3（刺激RF1和RF2的活性） 釋放因子作用于A位點(diǎn)，并且需要P位被肽基tRNA占據(jù)，此過(guò)程需要肽基的轉(zhuǎn)移以及空載tRNA逐出核糖體,78,79,tRNA和mRNA在核糖體中的移動(dòng),mRNA 和 tRNA 以相同的方向穿過(guò)核糖 體,80,6.5.1 合成起始,需要甲硫氨酰tRNA、ATP、GTP和十幾種起始因子(

30、eIF)參與,eIF2 3種亞基 形成三元起始復(fù)合體（eIF2, GTP, tRNA),eIF1 15kd 促使mRNA 與40S亞基結(jié)合 eIF3 500kd 促使mRNA 與40S亞基結(jié)合 eIF4b 80kd 促使mRNA 與40S亞基結(jié)合,eIF4a 50kd 促使與mRNA ,GTP結(jié)合,eIF4C 19kd 促使兩亞基結(jié)合,eIF5 150kd 釋放eIF2, eIF3,eIF4e (eIF4f 的亞基) 與5端帽子結(jié)合,起始因子,6.5 真核生物的翻譯過(guò)程,81,真核生物的起始復(fù)合物40S小亞基不是在起始密碼子AUG處形成，而是首先在mRNA的5末端形成，其識(shí)別信號(hào)是mRNA 5

31、末端的帽子結(jié)構(gòu) 在帽子處形成的起始復(fù)合物沿著mRNA移動(dòng)，在向下游移動(dòng)過(guò)程中掃描翻譯起始密碼子前的信號(hào)，直到發(fā)現(xiàn)起始密碼子AUG，60S亞基結(jié)合上來(lái)形成80S核糖體 起始因子的作用細(xì)節(jié)大多不太清楚,82,Initiation of translation in Euk.,eIF-2,GTP,Subunit Initiation Complex,Subunit binding to end of mRNA,Triplex complex,1. GTP首先與eIF2結(jié)合，這一結(jié)合增加了eIF2與起始tRNA的親和力，然后三者結(jié)合成一個(gè)三元復(fù)合物,3. 40S亞基三元復(fù)合物在eIF3的存在下與mRN

32、A結(jié)合，這一過(guò)程需要水解1分子ATP以提供能量,4. 起始復(fù)合物沿著mRNA向起始密碼子AUG移動(dòng)以便形成80S核糖體,2. 三元復(fù)合物直接與40S亞基結(jié)合，這一過(guò)程不需要mRNA的存在,83,6.5.2 肽鏈的延伸,肽鏈的延伸是將mRNA的核苷酸序列翻譯為多肽鏈的氨基酸序列的過(guò)程，其中翻譯的準(zhǔn)確性是該過(guò)程的關(guān)鍵,（1）延伸因子 真核生物中普遍存在的是eEF1和eEF2，在真菌中還有eEF3 eEF1：多聚蛋白質(zhì)，主要負(fù)責(zé)氨?；鵷RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至核糖體。大多數(shù)生物中由4種不同的亞基組成，分別為、 和 eEF2：是單體蛋白質(zhì)分子，能與GTP結(jié)合，GTP是eIF2發(fā)揮功能所必需。 eIF2參與移位，具

33、有GTP酶活性 eEF3：在釀酒酵母、白色念珠菌和裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)，由一條多肽鏈組成，具有結(jié)合和水解ATP和GTP的能力，功能還不清楚,84,（2）延伸循環(huán),與原核生物相似，分為進(jìn)位、肽鍵形成和移位三個(gè)階段。,進(jìn)位：是指aa-tRNA進(jìn)入A位。 aa-tRNA是以eEF-1-GTP- aa-tRNA復(fù)合物的形式進(jìn)入A位，并需要GTP的水解，在此過(guò)程中，如何保證正確aa-tRNA的進(jìn)入即翻譯的準(zhǔn)確性是一關(guān)鍵問(wèn)題 肽鍵形成： aa-tRNA進(jìn)位后立即形成肽鍵。肽鍵形成是在大亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的催化下完成的 移位：過(guò)程還不了解。移位需要eEF2參與。,85,（3）合成終止,合成終止是在終止因子的作用

34、下肽鏈停止延伸及核糖體與mRNA分離的過(guò)程。,終止因子只有一種為eRF，能識(shí)別三種終止密碼子UAA、UAG和UGA,終止的機(jī)制：當(dāng)核糖體移動(dòng)到終止密碼子處時(shí)，由于沒(méi)有氨酰基tRNA能對(duì)其識(shí)別，核糖體將在此處暫停， eRF因子可以識(shí)別終止密碼子，并與核糖體形成復(fù)合物，引起肽鏈的釋放，在核糖體釋放因子(ribosome releasing factor)的共同作用下，核糖體與mRNA解離，肽鏈延伸終止。,86,6.6 翻譯初始產(chǎn)物的后加工,由核糖體釋放的新生肽鏈并不是一個(gè)完整的、有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，必須經(jīng)過(guò)后加工，才具有生物學(xué)活性，包括形成高級(jí)結(jié)構(gòu)、與其他亞基締合及其他的共價(jià)修飾。,6.6.

35、1 肽鏈中氨基酸殘基的化學(xué)修飾,肽鏈中氨基酸殘基的化學(xué)修飾是翻譯后處理的重要內(nèi)容，反應(yīng)的主要類型有以下幾種：,87,88,乙?；?主要發(fā)生在N末端的氨基和賴氨酸的氨基上 甲基化： 發(fā)生在氨基、 氨基、精氨酸的胍基和C末端的羧基和側(cè)鏈的羧基上 磷酸化： 主要發(fā)生在絲氨酸的羥基和蘇氨酸及酪氨酸的羥基上 泛酸化：發(fā)生在氨基和氨基上 轉(zhuǎn)氨基酸作用：主要發(fā)生在N末端的氨基上 多聚ADP核糖基化：主要發(fā)生在精氨酸的胍基上 糖基化：可以通過(guò)N糖苷鍵連接于天冬氨酰的酰氨基上，也可以通過(guò)O糖苷鍵連接于絲氨酸和蘇氨酸的羥基上以及羥賴氨酸和羥富氨酸的羥基上，也可以通過(guò)S糖苷鍵連接于半胱氨酸的巰基上,89,6.6.

36、2 肽鏈N端甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸的除去,成熟的蛋白質(zhì)末端大部分不是甲硫氨酸，故必須切去N端的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。甲酰基由脫甲酰酶催化去除。,6.6.3 信號(hào)肽的切除,無(wú)論原核生物還是真核生物，蛋白質(zhì)除游離于胞漿內(nèi)發(fā)揮作用外，還有一部分要分泌到細(xì)胞外和定位于膜系統(tǒng)中起作用 如革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜具有兩層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜含有與能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白質(zhì)；外膜有促進(jìn)離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)，膜周質(zhì)中含有水解酶及其他蛋白質(zhì),90,真核生物細(xì)胞更加復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)有各種不同的細(xì)胞器，每種細(xì)胞器又有不同的膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位更加復(fù)雜 蛋白質(zhì)不但要決定是否越膜，還要決定要越膜的種類。在越膜過(guò)程中，

37、有時(shí)要在翻譯的同時(shí)發(fā)生一些處理過(guò)程（cotranslational processing），而翻譯后發(fā)生的共價(jià)修飾稱為翻譯后加工（post translational processing）,91,6.6.4 肽鏈的折疊,肽鏈的折疊在肽鏈合成沒(méi)有結(jié)束時(shí)就已經(jīng)開(kāi)始。核糖體可保護(hù)30至40個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的肽鏈，當(dāng)肽鏈從核糖體中露出后，便開(kāi)始折疊 三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成幾乎和肽鏈合成的終止同時(shí)完成。例如，大腸桿菌半乳糖苷酶的抗體可識(shí)別酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，能與合成該酶的多核糖體結(jié)合。該酶的活性形式為四聚體，當(dāng)新生的肽鏈還未由核糖體釋放時(shí)，就能與游離的酶分子形成活性形式。說(shuō)明高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成在合成終止前就開(kāi)始了。由此可

38、見(jiàn)，蛋白質(zhì)的折疊是從N端開(kāi)始的,92,6.6.5 切除前體中功能不必需肽段,6.6.6 二硫鍵的形成,在蛋白質(zhì)的前體分子中，有一些肽段是功能所不需要的，在成熟的分子中不存在。肽段的切除是在專一性的蛋白水解酶的作用下完成的。如前胰島素原的加工過(guò)程中去除了分子內(nèi)部的連接肽(C肽)。多種多肽激素和酶的前體大都要經(jīng)過(guò)這一加工過(guò)程。,在mRNA分子中，沒(méi)有胱氨酸的密碼子，而不少蛋白質(zhì)分子中含有胱氨酸二硫鍵，有的還有多個(gè)，且二硫鍵是蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)。二硫鍵是通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸的巰基氧化形成的，有的在切除肽段前就已形成。,93,6.6.7 多肽鏈N端和 C端的修飾,在少數(shù)情況下，合成的多肽一端或兩端存在修飾氨

39、基酸，如微管蛋白的鏈在酶的作用下C端能被酪氨酸修飾，且不需要tRNA。還發(fā)現(xiàn)一種能從活化的tRNA上將氨基酸殘基轉(zhuǎn)移到成熟的蛋白質(zhì)N端上。哺乳動(dòng)物中也有類似的現(xiàn)象，意義不詳。 在病毒和細(xì)菌中，有些蛋白質(zhì)N端氨基被乙酰化； 在真核生物中，細(xì)胞中有半數(shù)以上的蛋白質(zhì)N端被乙?；?乙?；躈乙酰轉(zhuǎn)移酶催化，該酶對(duì)N端氨基酸有選擇性，能被修飾的有：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和天冬氨酸?？赡芫哂姓{(diào)解蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用 多數(shù)多肽的C端被酰胺化，特別是多肽激素，如催產(chǎn)素、加壓素、促胃液素、縮膽囊素和分泌素。酰胺化能保護(hù)多肽免受外切酶的水解 另外N端還有葡萄糖胺和脂肪酸基團(tuán)的修飾等,6.7 蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制

40、,在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的合成位點(diǎn)與功能位點(diǎn)常常被一層或多層細(xì)胞膜所隔開(kāi)，這樣就產(chǎn)生了蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的問(wèn)題。 真核生物細(xì)胞內(nèi)，幾乎在任何時(shí)候，都有數(shù)以百計(jì)或千計(jì)的蛋白質(zhì)離開(kāi)核糖體并被輸送到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體、葉綠體等各個(gè)部分，補(bǔ)充和更新細(xì)胞功能。 由于細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，因此合成的蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無(wú)誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。,95,In Prok. - 核糖體附著在細(xì)胞內(nèi)膜（inner membrane）,蛋白質(zhì)合成方式,游離型與分泌型合成蛋白質(zhì)的核糖體 在結(jié)構(gòu)與功能上沒(méi)有差別,蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)可分為兩大類：翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制和翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 分泌蛋白質(zhì)大多是以翻譯

41、-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)?。在?xì)胞器發(fā)育過(guò)程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)?。而參與生物膜形成的蛋白質(zhì)，則依賴于上述兩種不同的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制鑲?cè)肽?nèi),跨膜運(yùn)輸和鑲?cè)肽?nèi)的幾種主要蛋白質(zhì),97,細(xì)胞溶質(zhì),分泌泡,溶酶體,98,6.7.1 翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制 蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)肽假說(shuō),分泌蛋白是一類典型的翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)同步進(jìn)行的蛋白質(zhì) 分泌是蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)部釋放到胞外空間的過(guò)程 一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)定位的信息存在于該蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)中，并且通過(guò)與膜上特殊受體的相互作用得以表達(dá)，這就是信號(hào)肽假說(shuō)的基礎(chǔ),信號(hào)肽假說(shuō)認(rèn)為，蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)信號(hào)也是由mRNA編碼的。在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序

42、列的RNA區(qū)域，這個(gè)氨基酸序列被稱為信號(hào)肽。信號(hào)肽合成后便與膜上特定受體相互作用，帶正電的信號(hào)肽與帶負(fù)電荷的磷脂膜作用，引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)膜，產(chǎn)生通道，允許這段多肽在延長(zhǎng)的同時(shí)穿過(guò)膜結(jié)構(gòu)，因此，這種方式是邊翻譯邊跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)。,100,signal S. 的基本結(jié)構(gòu),101,signal Seq.引導(dǎo)的穿膜機(jī)制,-signal S. 帶正電的區(qū)段與帶負(fù)電的磷脂膜互作, 引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入 inner M.,102,- 疏水區(qū)段嵌入磷脂膜內(nèi)或形成helix, - 并對(duì)磷脂雙層膜產(chǎn)生擾動(dòng)效應(yīng)， - 誘發(fā)形成非脂雙層結(jié)構(gòu)， 以保證Signal S. 所牽引的蛋白質(zhì)順利穿膜,103,104,真核生物細(xì)胞質(zhì)中合成

43、的蛋白質(zhì)如何到達(dá)不同的部位取決于蛋白質(zhì)是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào) 如果沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，蛋白質(zhì)就保留在細(xì)胞質(zhì)中。不同的細(xì)胞定位需要不同的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào) 細(xì)胞表面蛋白、分泌蛋白和溶酶體蛋白（統(tǒng)稱為分泌蛋白）具有與原核生物相似的信號(hào)肽。真核生物的信號(hào)肽也能形成螺旋的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在信號(hào)肽識(shí)別顆粒(signal recognition particle，SRP)協(xié)助下插入到糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中 新生肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，SRP和DP(docking protein又稱SRP受體蛋白)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程,真核細(xì)胞分泌蛋白穿膜的分子模式,105,絕大部分被運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)信號(hào)肽，該序列常位于蛋白質(zhì)的氨基末端

44、，長(zhǎng)度一般在13-36個(gè)殘基之間，有3個(gè)特點(diǎn)： （1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸； （2）在靠近該序列N-端常常有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸； （3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）。,106,SRP是一個(gè)RNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，由 7 SL RNA和 6種蛋白質(zhì)組成。其中，7 SL RNA由 300個(gè)核苷酸組成 SRP有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是信號(hào)肽識(shí)別結(jié)構(gòu)域，由7 SL RNA中的100至250個(gè)核苷酸與 19、54、68和 72 kDa蛋白質(zhì)構(gòu)成，另一個(gè)由7 SL RNA的其他部分與9和14 kDa蛋白質(zhì)組成，使肽鏈延伸暫停，叫做延伸作用制動(dòng)結(jié)構(gòu)域，即當(dāng)SRP與DP結(jié)合后，多肽合成恢復(fù),SRP能同時(shí)識(shí)別正在合成需要通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)的新生肽和結(jié)合核糖體，SRP與信號(hào)肽結(jié)合是多肽正確運(yùn)轉(zhuǎn)的前提，但同時(shí)也導(dǎo)致了該多肽合成的暫時(shí)終止（此時(shí)新生肽一般長(zhǎng)約70個(gè)殘基左右）。SRP-信號(hào)肽-核糖體復(fù)合物即被引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并與SRP的受體DP相結(jié)合。SRP與DP結(jié)合后，多肽合成恢復(fù)。信號(hào)肽通過(guò)膜上