基因工程的基本原理和技術(shù).ppt

1、教學(xué)目標(biāo),知識與能力 1.簡述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具的作用。 2.認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。 二、 教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn) 1.教學(xué)重點(diǎn)： DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。 2.教學(xué)難點(diǎn): 基因工程載體需要具備的條件。,基因工程,每100kg 豬或牛的胰腺中僅可提取45g。,1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。,治療糖尿病特效藥,據(jù)調(diào)查： 2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。,胰島素,抗蟲害的玉米,轉(zhuǎn)基因鮭魚,基因工程產(chǎn)品,基因工程的產(chǎn)物,轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生長激

2、素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷),什么叫基因工程？,基因工程又叫DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。,（一）基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,剪切, 拼接, 導(dǎo)入, 表達(dá),按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，定向改變生物遺傳特性，創(chuàng)造出新型生物,基因工程研究的理論基礎(chǔ),科技探索之路,早期基礎(chǔ)理論,達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論,科技探索之路,早期基礎(chǔ)理論,孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律,科技探索之路,早期基礎(chǔ)理論,

3、摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,克里克等提出中心法則,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程,DNA是遺傳物質(zhì)的證明 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立 遺傳密碼的破譯（

4、遺傳密碼的通用性） 基因運(yùn)載體的發(fā)現(xiàn) 工具酶的發(fā)明 DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明 DNA體外重組的實(shí)現(xiàn) 重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功 第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世 PCR技術(shù)的發(fā)明,問題探討：,蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。 讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。 想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？,普通棉花抗蟲棉,基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來,關(guān)鍵步驟二：,抗蟲基因與棉花DNA“縫合”,關(guān)鍵步驟三：,抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,“分子縫紉針” DNA連

5、接酶,“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,DNA重組技術(shù)的基本工具,限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀” DNA連接酶“分子縫紉針” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,1、主要來源： 2、特點(diǎn)： 3、作用：,識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列（不同的限制酶能識別不同特點(diǎn)的核苷酸序列），并且以不同的方式在兩個(gè)特殊堿基之間切斷DNA雙鏈。,主要從微生物中分離純化,使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開,磷酸二酯鍵,H2O +,4、限制酶識別序列,Go on,大多數(shù)限制酶的識別序列由6個(gè)核苷酸組成 少數(shù)的識別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成,限制酶的

6、識別序列：,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,重復(fù)演示,Go back,什么叫黏性末端？,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵,將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈,限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)的脫氧核苷酸。,Go back,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端

7、？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,不同來源的DNA片段混合,將不同種來源的DNA片段連接起來,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC CTTAAG,酶切,GAATTC CTTAAG,同一種,可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，,Ecoli DNA連接酶或T4DNA連接酶,即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,二、“分子縫合針” DNA連接

8、酶,作用:,恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,作用原理：,催化磷酸二酯鍵形成,DNA連接酶“分子縫紉針”,連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為Ecoli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。 這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。 Ecoli連接酶只能連接黏性末端； T4連接酶既可“縫合”黏性末端，又可“縫合”平末端。,T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低,T4DNA連接酶,類型：,EcoliDNA連接酶,T4DNA連接酶,來源,功能,大腸桿菌,T4噬菌體,恢復(fù) 磷酸 二酯鍵,只能連

9、接黏性末端,能連接黏性末端和平末端(效率較低),相同點(diǎn),差別,尋根問底,DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,形成磷酸二酯鍵,1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈,2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板,外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？,導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具運(yùn)載體。,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體”分子運(yùn)輸車”,運(yùn)載體的作用有哪些？,作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。

10、 作用二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對外源基因(抗蟲基因)進(jìn)行大量復(fù)制。,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？ 假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？ 作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？ 目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？,作為運(yùn)載體必須具備哪些條件？,1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。 2）載體DNA必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便目的基因插入到載體上去。 3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。 如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。 載體DNA必須是安全的,不會(huì)對受體細(xì)胞有害,或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去; 5) 載體

11、DNA分子大小應(yīng)適合,以便提取和在體外進(jìn)行操作,太大就不便操作.,常用的運(yùn)載體主要有兩類： 1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒,常用的載體：質(zhì)粒,能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制,有切割位點(diǎn),有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別,1.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同種限制酶 B. 兩種限制酶 同種連接酶 D. 兩種連接酶,A,課堂練習(xí),2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,課堂練習(xí),3.以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,課堂練習(xí),種類與命名：,現(xiàn)在已經(jīng)從約3