堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定

1、.堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^(guò)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）米氏常數(shù)的測(cè)定，了解其測(cè)定方法和意義。學(xué)會(huì)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定酶的活性及觀察抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，加深對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的理解?！緦?shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含量成正比。根據(jù)吸光值的大小可以計(jì)算出酶的活性，也可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查知酚的含量，進(jìn)而算出酶活性的大小?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1. 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響(1) 取6支試管，作好標(biāo)記。按下表操作：（未加抑

2、制劑組）試劑/ml管號(hào)1234560.01 mol/L底物液 0.100.200.300.400.800.0pH10.0, 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液 0.700.700.700.700.700.70蒸餾水 1.101.000.900.800.401.2037水浴中保溫5分鐘AKP酶液 0.100.100.100.100.100.10最終底物濃度(mmol/L) 0.51.01.52.04.00.0另取6支試管，做好標(biāo)記。按下表操作：（高精氨酸組）試劑/ml管號(hào)1234560.01mol/L底物液 0.100.200.300.400.800.05mmol/L高精氨酸溶液0.100.100.

3、100.100.100.10pH10.0,0.1 mol/碳酸鹽緩沖液 0.700.700.700.700.700.70蒸餾水 1.050.950.850.750.351.1537水浴中保溫5分鐘AKP酶液 0.100.100.100.100.100.10最終底物濃度(mmol/L)0.51.01.52.04.00.0(2) 加入酶液(0.05g/ml)后,各管混勻并立即記錄時(shí)間,將上述各管置37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘。(3) 保溫結(jié)束，立即加堿性溶液1.1 ml終止反應(yīng)。(4) 各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml，0.5%鐵氰化鉀2.0 ml，充分混勻，放置10分鐘，以6號(hào)空

4、白管作對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處比色，根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。(5) 以各管基質(zhì)濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，以各管吸光度值的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)為1/V做橫坐標(biāo)，作圖求出Km值。2.酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1) 取潔凈干燥試管6支，按下表依次加入試劑： (2) 混勻后室溫放置15分鐘，于510 nm波長(zhǎng)處比色。(3) 以酚含量（g）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑/ml管號(hào)1234560.1 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00.050.100.200.300.40蒸餾水 2.01.951.901.801.701.6037水浴保溫5分鐘 堿性溶液1.101.101.101.101.1

5、01.100.3%4-氨基安替比林 1.01.01.01.01.01.0 0.5%鐵氰化鉀 2.02.02.02.02.02.0【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】1.未加抑制劑組底物濃度S (mmol/L)0.500 1.000 1.500 2.000 4.000 濃度倒數(shù)1/S2.000 1.000 0.667 0.500 0.250 吸光度V0.129 0.246 0.288 0.387 0.752 吸光度倒數(shù)1/V7.752 4.065 3.472 2.584 1.330 得到擬合直線方程：y=3.5275x+0.7246根據(jù)1V=KmVmax*1S+1Vmax可得到：Vmax=1/0.7246=1.3

6、82, Km=Vmax*3.5275=4.8712.高精氨酸組底物濃度S (mmol/L)0.500 1.000 1.500 2.000 4.000 濃度倒數(shù)1/S2.000 1.000 0.667 0.500 0.250 吸光度V0.130 0.259 0.303 0.446 0.624 吸光度倒數(shù)1/V7.692 3.861 3.300 2.242 1.603 得到擬合直線方程：y = 3.4764x + 0.6688根據(jù)1V=KmVmax*1S+1Vmax可得到：Vmax=1/0.6688=1.495， Km=Vmax*3.4764=5.1983.酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：由上述圖表來(lái)看，在加入高精氨酸抑制酶活性后，酶的Km值增大，Vm值也增大【實(shí)驗(yàn)討論】1. 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，滴加試劑和反應(yīng)時(shí)間的控制一定要準(zhǔn)確，以保證得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. Km值指最大反