質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測定方法的建立.ppt

1、1,藥品研究及生產(chǎn)過程中有關(guān)物質(zhì)的控制方法和要求,化學(xué)二室 謝沐風(fēng) 2005年4月,2,有關(guān)物質(zhì)的來源 原料藥合成過程中帶入; 制劑過程中產(chǎn)生; 或是在貯藏、運(yùn)輸、使用過程中產(chǎn)生。 控制的必要性,3,有關(guān)物質(zhì)的測定方法 儀器角度： 高效液相色譜法（HPLC法）、 薄層色譜法（TLC法）、 紫外分光光度法（UV法）、 氣相色譜法（GC法）、 毛細(xì)管電泳色譜法（CE）等 試驗(yàn)角度： 對照品法 自身（稀釋）對照法 歸一化法,4,有關(guān)物質(zhì)的計(jì)算方法 雜質(zhì)對照品法 加響應(yīng)因子（即重量校正因子）計(jì)算 的自身對照法、 不加響應(yīng)因子計(jì)算的自身對照法 根據(jù)不同雜質(zhì)采用不同方法等。 有關(guān)物質(zhì)的計(jì)算方法 定量檢測和

2、限度檢測,5,高效液相色譜法（HPLC法）,1 .色譜條件的確定（即專屬性試驗(yàn)） 專屬性是提供被分析物在雜質(zhì)和輔料存在時(shí)能被區(qū)分的證明，通常采用在純物質(zhì)（原料或制劑）中加入一定量的雜質(zhì)或輔料，證明各雜質(zhì)均可與被分析物分離。 配制含有1%(w/w)濃度各中間體（即各雜質(zhì)）的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液，來確證色譜條件的適用性。,6,專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜,7,2 . 檢測波長的確定 涉及到各被檢測物質(zhì)在該波長下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（f=A雜質(zhì)/A被測成分） 選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長（f=1.0）。 選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長（f1

3、.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。 如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應(yīng)必須加入重量校正因子（f1.0），否則將得到錯(cuò)誤的判斷。 目前國外有關(guān)該項(xiàng)研究的進(jìn)展,8,3. 供試品溶液濃度的確定 （靈敏度試驗(yàn)最低檢出量的測定） 供試品溶液濃度的設(shè)定至關(guān)重要。通常其設(shè)定是依據(jù)最低檢出量和最大進(jìn)樣量來進(jìn)行的。 最低檢出量雖然是個(gè)絕對值，但其真正的意義確是其相對值，即相對于供試品溶液中樣品濃度的多少而言。 其測定方法分為直觀評(píng)價(jià)法和依據(jù)信躁比兩種方法。 最大進(jìn)樣量以不斷增加樣品溶液濃度，直至被分析物不拖尾的濃度為準(zhǔn)。,9,3. 供試品溶液濃度的確定 設(shè)定雜質(zhì)總量不得過1.0%，最低檢出量通

4、常需達(dá)到對照溶液濃度的1/101/50（即相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.1%0.02%）。也就是說供試品溶液的濃度至少是最低檢出量的1000倍 20000 倍，又由于最低檢出量受各因素的不同而改變（即耐受性因數(shù)），故供試品溶液的濃度在保證不拖尾的情況下（即小于最大進(jìn)樣量），可在此基礎(chǔ)上再設(shè)定的高一些，以保證該濃度可適用各種條件。,10,3. 供試品溶液濃度的確定 舉例說明：進(jìn)樣量為20l，主成分的最低檢出量為1g/ml（以濃度表示），規(guī)定雜質(zhì)限度為1%，此時(shí)供試品溶液的濃度可設(shè)定為 1mg/ml 20mg/ml，或者再高一些，但始終需保持主成分峰不拖尾為準(zhǔn)，即不超過最大進(jìn)樣量。 拖尾情況也可通過流

5、速進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié),11,3. 供試品溶液濃度的確定,12,4. 加樣回收試驗(yàn)（即準(zhǔn)確性試驗(yàn)） 準(zhǔn)確性試驗(yàn)可采用樣品中加入已知量雜質(zhì)的方式來評(píng)價(jià)。準(zhǔn)確稱量各雜質(zhì)，將含有1% (w/w)濃度的各雜質(zhì)加入到樣品溶液中，以驗(yàn)證所采用的色譜條件是否可分離檢出出相應(yīng)的各雜質(zhì)。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。,13,5. 流速、柱溫與溶劑的選擇 在測定時(shí)通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時(shí)間稍長些，且使主成分峰不拖尾即可。 柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過35。 溶劑的選擇應(yīng)測定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強(qiáng)的溶劑；同時(shí)應(yīng)保證對照溶液的主成分峰面積精

6、密度良好。,14,6. 積分參數(shù)的設(shè)定 積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(Min Area)組成。 采用自身對照法時(shí)，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進(jìn)行積分計(jì)算。 這里主要是供試品溶液的最小峰面積設(shè)定，它將直接導(dǎo)致測定結(jié)果。設(shè)定的太小，會(huì)導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定的太大，又將反應(yīng)不出雜質(zhì)的存在情況。,15,6. 最小峰面積的設(shè)定 其設(shè)定，不是絕對值，而是相對值。 英國藥典中有明確的說明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測采用HPLC法測定時(shí)，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之

7、幾的峰面積。普通樣品測定時(shí)，通常為1/10 1/20（即相當(dāng)于樣品測定濃度的0.1%0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為1000500左右。新藥穩(wěn)定性考核時(shí)，可設(shè)定到0.01%的最小峰面積。 同時(shí)請大家注意，在進(jìn)行原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達(dá)成一致意見，此點(diǎn)應(yīng)予以重視。,16,7. 保留時(shí)間的設(shè)定 經(jīng)過上述方法學(xué)認(rèn)證后，確定供試品溶液的保留時(shí)間，通常以洗脫出全部雜質(zhì)和經(jīng)強(qiáng)力破壞試驗(yàn)出的雜質(zhì)，規(guī)定至主成分保留時(shí)間的幾倍為止。,17,8. 強(qiáng)力破壞試驗(yàn) 水破壞 取原料適量，加水溶解后，在90放置24小時(shí)。 氧化破壞 取原料適量，

8、用5%過氧化氫溶液溶解后，在90放置24小時(shí)。 強(qiáng)堿破壞 取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90放置24小時(shí)。 強(qiáng)酸破壞 取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90放置24小時(shí)。 高溫破壞 取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點(diǎn)不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變 強(qiáng)光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射48小時(shí)。,18,9. 定量檢測 如有關(guān)物質(zhì)的檢查為定量檢測，即為雜質(zhì)對照品法，在上述項(xiàng)目的各項(xiàng)研究后，需增加線性試驗(yàn)以及一些必要的方法論證項(xiàng)目。,19,10. HPLC/UV二極管陣列檢測器 采用二極管陣列檢測器進(jìn)行論證，也是目前常采用的一個(gè)強(qiáng)有力的手段。它通過對一個(gè)色譜峰的幾點(diǎn)進(jìn)行紫外

9、掃描，然后比較所得到的掃描圖譜的接近程度從而評(píng)價(jià)被檢測峰的純度。 我室有一臺(tái)該檢測器，曾多次做過該方面的工作。,20,薄 層 色 譜 法,薄層色譜法由于既可檢測具有紫外吸收的物質(zhì)，又可檢測不具有紫外吸收，因此也被廣泛地應(yīng)用。但由于其不具有準(zhǔn)確定量的性質(zhì)，故其應(yīng)用受到一定的限制。 1. 展開劑的確定 與HPLC法相同，配制含有1%濃度各中間體的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液進(jìn)行試驗(yàn)，來確證展開劑的適用性。,21,2 . 檢測方法的確定 可采用紫外燈下檢測，由于通常只具有兩種波長254mn和360nm，故測定有其局限性。 采用顯色的方法進(jìn)行時(shí)，通常噴以顯色劑后需立即檢視。,22,3 .

10、供試品溶液與對照溶液濃度的確定 （靈敏度試驗(yàn)最小檢出點(diǎn)樣量的測定） 其原理與HPLC法相同。 最低檢出量可采用不斷稀釋樣品溶液濃度，點(diǎn)樣直至觀測不到為止。 最大點(diǎn)樣量可采用不斷增加樣品溶液濃度，直至不拖尾的濃度為準(zhǔn)。 通常考慮到試驗(yàn)?zāi)褪苄砸蛩氐挠绊?，將供試品溶液濃度設(shè)定為比最大點(diǎn)樣量略小一些為好。 該項(xiàng)試驗(yàn)要求必須附有試驗(yàn)的點(diǎn)樣圖譜照片。 目前USP、BP、EP中的一些規(guī)定。,23,4 .定量的確定 由于TLC法通常無法準(zhǔn)確定量，故可采用配制一系列濃度的對照溶液來衡量雜質(zhì)介于何種濃度之間的方法進(jìn)行，但此法較為煩瑣。,24,紫外分光光度法（UV法）,在一些溶液劑的雜質(zhì)檢測中，也常采用在可見區(qū)某波

11、長處測定樣品溶液的吸收度值，以不超過某限度為準(zhǔn)的方法。 這里需注意的是，同時(shí)需附有溶劑、輔料（制劑時(shí)）的紫外掃描圖譜，以驗(yàn)證該法的專屬性。,25,有關(guān)物質(zhì)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制訂,1. 通常在原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，需制訂有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。制劑時(shí)，如經(jīng)制劑工藝后，與原料藥比較有關(guān)物質(zhì)有所增加或經(jīng)穩(wěn)定性考核后，有關(guān)物質(zhì)量有所增加，均應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，如未有明顯增加，可考慮不予以制訂。,26,有關(guān)物質(zhì)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制訂,2. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，應(yīng)規(guī)定理論板數(shù)按主成分峰計(jì)應(yīng)不低于多少（通常為2000） ，且最好能將相應(yīng)的雜質(zhì)（該雜質(zhì)為最難分離的）訂入，以用于系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液的配制，將雜質(zhì)的濃度配制為主成分濃度的1%進(jìn)行試驗(yàn)，從而確保本試驗(yàn)在各種條件下均可準(zhǔn)確進(jìn)行。該法已在USP、BP、進(jìn)口樣品和國外藥品資料中多次采用。,27,有關(guān)物質(zhì)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制訂,2. 舉例說明： 如： 供試品溶液濃度為0.5mg/ml； 對照溶液濃度為5g/ml（限度為1.0%） 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液： 對照品溶液濃度為0.5mg/ml； 最難分離雜質(zhì)對照品濃度為5g/ml（1